Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay
Summary
Der durchnässte Perlenassay beinhaltet die gezielte Abgabe von Testreagenzien zu jedem Entwicklungszeitpunkt, um die Regulation der Zelldifferenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Es wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das auf jedes Versuchstiermodell anwendbar ist, um drei verschiedene Arten von getränkten Perlen herzustellen und diese in die Zwischenziffer eines Hühnerembryos zu implantieren.
Abstract
Eine Vielzahl von genetischen Programmen wird während der Embryonalentwicklung aktiviert, die die Zelldifferenzierung orchestrieren, um eine erstaunliche Vielfalt an somatischen Zellen, Geweben und Organen zu erzeugen. Die präzise Aktivierung dieser genetischen Programme wird durch Morphogene reguliert, diffusible Moleküle, die das Zellschicksal an verschiedenen Schwellenwerten lenken. Um zu verstehen, wie die genetische Aktivierung die Morphogenese koordiniert, müssen lokale Wechselwirkungen untersucht werden, die während der Entwicklung durch Morphogene ausgelöst werden. Die Verwendung von Perlen, die mit Proteinen getränkt sind, oder von Medikamenten, die in verschiedene Regionen des Embryos implantiert werden, ermöglicht es, die Rolle bestimmter Moleküle bei der Etablierung von Ziffern und anderen Entwicklungsprozessen zu untersuchen. Diese experimentelle Technik liefert Informationen über die Kontrolle der Zellinduktion, des Zellschicksals und der Musterbildung. Somit ist dieser durchnässte Perlen-Assay ein äußerst leistungsfähiges und wertvolles experimentelles Werkzeug, das auf andere embryonale Modelle anwendbar ist.
Introduction
Durchbrüche in den molekularen Mechanismen, die die Genexpression während der Embryonalentwicklung steuern, haben es uns ermöglicht zu verstehen, wie das Schicksal der Zellen bestimmt wird. Die Bindung an verschiedene Zelllinien erfolgt, sobald die Zellen mit der molekularen Expression von Transkriptionsfaktoren1 beginnen. Dieses Expressionsmuster ist räumlich und zeitlich hochgradig koordiniert und steuert dadurch die Formgebung, Positionierung und Musterung von Zellen, Geweben und Organen 1,2,3,4,5. Die embryonale Induktion ist der Prozess, bei dem Zellen an bestimmte Linien gebunden werden, indem sie Hierarchien aufbauen, die die Potentialität der Zellen einschränken, die sogar die Generierung des grundlegenden Körperplans umfassen, wie es beim Spemann-Organizer 6,7 der Fall ist. Die blastopore dorsale Lippe induziert eine zweite embryonale Achse in einem Wirtsembryo 8,9. Heute ist mit Hilfe von Pfropfung und anderen klassischen Experimenten in Kombination mit molekularen Ansätzen bekannt, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren die embryonale Induktion im Spemann-Organizer10 steuern. Daher ist die experimentelle Manipulation ein wichtiges Werkzeug, um Zelldifferenzierungs-, Morphogenese- und Musterungsprozesse während der Embryogenese zu verstehen.
Interessanterweise werden in embryonalen Systemen, in denen die Gewebetransplantation schwierig ist oder die Induktoren bereits bekannt sind, Träger verwendet, um Moleküle (z. B. Proteine, Chemikalien, Toxine usw.) zu liefern, um die Zelldifferenzierung, die Morphogenese und sogar die Strukturierung zu regulieren. Ein solches Trägersystem beinhaltet die Implantation von Perlen, die in einem bestimmten Molekül getränkt sind, in einen experimentellen Modellorganismus zu einem beliebigen Entwicklungszeitpunkt, um die Wirkung des genannten Reagenzes zu bestimmen oder die Differenzierung des genannten Modells zu steuern. Zum Beispiel zeigten Cheryl Tickle et al. (1985) durch die Implantation von Retinsäure (RA)-getränkten Perlen in die Hühnerflügel-Gliedmaßenknospe, dass RA die Expression von Schalligel in der Zone der Polarisationsaktivität (ZPA) induziert1,12. Die gleiche experimentelle Strategie wurde verwendet, um herauszufinden, dass RA die Asymmetrie von Somiten und den Zelltod in der Gliedmaßenknospe während der Ziffernentwicklung und in anderen embryonalen Gliedmaßenregionen kontrolliert13,14,15. Andere Faktoren, hauptsächlich Proteine (z. B. Fibroblastenwachstumsfaktoren [FGF], transformierender Wachstumsfaktor-beta [TGF-ß]), wurden verwendet, um Gliedmaßen in frühen Embryonenflanken und neue Ziffern in der interdigitalen Region zu induzieren, bzw. 16,17,18,19,20,21 . Diese Experimente belegen die Leistungsfähigkeit und den Nutzen dieser Technik zur Bestimmung des Expositionsstadiums oder der Kompetenz von Geweben oder Zellgruppen, die den Molekülen ausgesetzt sind.
In diesem Protokoll diente das Kükenglied im Stadium der Ziffernbildung als experimentelles Modell, um Schritt für Schritt darzustellen, wie die getränkten Perlen vorbereitet und implantiert werden können. Dieses experimentelle Werkzeug ist jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern kann in jedem experimentellen Tiermodell und zu jedem Zeitpunkt in vitro und in vivo genutzt werden, um Induktion, Differenzierung, Zelltod und Strukturierung zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Hauptvorteil des in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Werkzeugs besteht darin, dass es in der Lage ist, den Zeitpunkt und den Ort der Exposition gegenüber Perlen zu kontrollieren, die in einem bestimmten experimentellen Molekül getränkt sind. Die Kombination der richtigen Positionierung mit präzisem Entwicklungstiming bietet enorme Möglichkeiten, Zelldifferenzierungsprozesse zu untersuchen. Die Durchführung dieser Experimente in undifferenziertem Gewebe ermöglicht die Untersuchung der ersten entsc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [Fördernummern IN211117 und IN213314] und Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [Fördernummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] unterstützt, die JC-M verliehen wurden. JC M-L erhielt ein Postdoc-Stipendium vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Die Autoren schätzen die Hilfe von Lic. Lucia Brito vom Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM in der Vorbereitung der Referenzen dieses Manuskripts.
Materials
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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