Анализ дифференцировки клеток, морфогенеза и паттернинга во время эмбриогенеза курицы с использованием анализа промокшей из бусин

Summary

Анализ на вымоченные шарики включает в себя целевую доставку тестового реагента в любой момент развития для изучения регуляции дифференцировки и морфогенеза клеток. Представлен подробный протокол, применимый к любой экспериментальной модели на животных, для приготовления трех различных типов размоченных шариков и их имплантации в интердигит куриного эмбриона.

Abstract

Во время эмбрионального развития активируется множество генетических программ, которые организуют дифференцировку клеток для создания поразительного разнообразия соматических клеток, тканей и органов. Точная активация этих генетических программ регулируется морфогенами, диффузными молекулами, которые направляют судьбу клеток при разных порогах. Понимание того, как генетическая активация координирует морфогенез, требует изучения локальных взаимодействий, вызванных морфогенами во время развития. Использование шариков, пропитанных белками, или лекарств, имплантированных в отдельные области эмбриона, позволяет изучить роль специфических молекул в установлении пальцев и других процессах развития. Этот экспериментальный метод предоставляет информацию о контроле индукции клеток, судьбе клеток и формировании паттернов. Таким образом, этот анализ на вымощенные бусины является чрезвычайно мощным и ценным экспериментальным инструментом, применимым к другим эмбриональным моделям.

Introduction

Прорывы в молекулярных механизмах, которые контролируют экспрессию генов во время эмбрионального развития, позволили нам понять, как определяется судьба клеток. Приверженность различным клеточным линиям происходит, как только клетки начинают молекулярную экспрессию факторов транскрипции¹. Этот паттерн экспрессии хорошо скоординирован в пространстве и времени и, таким образом, направляет формирование, позиционирование и паттерн клеток, тканей и органов 1,2,3,4,5. Эмбриональная индукция – это процесс, посредством которого клетки посвящаются определенным линиям путем установления иерархий, которые ограничивают потенциал клеток, которые даже включают в себя генерацию основного плана тела, как это происходит с организатором Spemann ^6,7. Бластопорная дорсальная губа индуцирует вторую эмбриональную ось у эмбриона-хозяина ^8,9. Сегодня с помощью прививки и других классических экспериментов в сочетании с молекулярными подходами известно, что различные факторы транскрипции и факторы роста функционируют для прямой эмбриональной индукции в органайзере Spemann¹⁰. Таким образом, экспериментальная манипуляция является важным инструментом для понимания клеточной дифференцировки, морфогенеза и паттерновых процессов во время эмбриогенеза.

Интересно, что в эмбриональных системах, где трансплантация тканей затруднена или когда индукторы уже хорошо известны, носители используются для доставки молекул (например, белков, химических веществ, токсинов и т. Д.) Для регулирования дифференцировки клеток, морфогенеза и даже паттернов. Одна из таких систем носителей включает имплантацию шариков, пропитанных определенной молекулой, в любой экспериментальный модельный организм в любой момент времени развития для определения эффекта указанного реагента или направления дифференцировки указанной модели. Например, путем имплантации шариков, пропитанных ретиноевой кислотой (РА), в почку конечности куриного крыла, Шерил Тикл и др. (1985) продемонстрировали, что РА индуцирует экспрессию звукового ежа в зоне поляризационной активности (ZPA)^11,12. Та же экспериментальная стратегия была использована, чтобы обнаружить, что РА контролирует асимметрию сомитов и гибель клеток в почке конечности во время развития пальцев и в других эмбриональных областях конечностей 13,14,15. Другие факторы, в основном белки (например, факторы роста фибробластов [FGF], трансформирующий фактор роста-бета [TGF-ß]) использовались для индуцирования конечностей в боках ранних эмбрионов и новых пальцев в межпальцевой области, соответственно 16,17,18,19,20,21 . Эти эксперименты свидетельствуют о силе и полезности этого метода для определения стадии приверженности или компетентности тканей или групп клеток, подвергающихся воздействию молекул.

В этом протоколе конечность цыпленка на стадии образования пальцев служила экспериментальной моделью для представления пошаговых способов подготовки и имплантации пропитанных шариков. Тем не менее, этот экспериментальный инструмент не ограничивается этим применением, но может быть использован в любой экспериментальной модели на животных и в любой точке времени in vitro и in vivo для изучения индукции, дифференцировки, гибели клеток и паттерна.

Protocol

Это исследование было рассмотрено и одобрено Институциональным наблюдательным советом по уходу за лабораторными животными и их использованию Института биомедических исследований Национального автономного университета Мексики (УНАМ, Мехико, Мексика). 1. Инкубация я…

Representative Results

Использование пропитанных шариков для оценки поведения клеток в эмбриональной конечности цыпленкаЧтобы обеспечить эффективность этого анализа, шарик должен быть размещен последовательно и точно в правильном месте; в данном случае дистальный – самый третий интердигит под …

Discussion

Основным преимуществом экспериментального инструмента, подробно описанного в этом протоколе, является возможность контролировать время и место воздействия шариков, пропитанных данной экспериментальной молекулой. Сочетание правильного позиционирования с точным временем развития д…

Materials

Affi-Gel Blue Gel beads	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 beads	Bio-Rad	1400123
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Heparine Sepharose beads	Abcam	ab193268
Petri dish	Nest	705001
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01