Analys av celldifferentiering, morfogenes och mönstrande under kycklingembryogenes med användning av blötläggningspärleanalysen

Summary

Den blötlagda pärlanalysen innefattar riktad leverans av testreagens vid vilken utvecklingspunkt som helst för att studera regleringen av celldifferentiering och morfogenes. Ett detaljerat protokoll, tillämpligt på alla försöksdjursmodeller, för beredning av tre olika typer av blötlagda pärlor och implantering av dessa i interdigit av ett kycklingembryo presenteras.

Abstract

En mängd genetiska program aktiveras under embryonal utveckling som orkestrerar celldifferentiering för att generera en häpnadsväckande mångfald av somatiska celler, vävnader och organ. Den exakta aktiveringen av dessa genetiska program regleras av morfogener, diffusibla molekyler som styr cellödet vid olika tröskelvärden. Att förstå hur genetisk aktivering samordnar morfogenes kräver studier av lokala interaktioner som utlöses av morfogener under utvecklingen. Användningen av pärlor som blötläggs i proteiner eller läkemedel implanterade i distinkta regioner i embryot gör det möjligt att studera specifika molekylers roll vid upprättandet av siffror och andra utvecklingsprocesser. Denna experimentella teknik ger information om kontrollen av cellinduktion, cellöde och mönsterbildning. Således är denna blöta pärlanalys ett extremt kraftfullt och värdefullt experimentellt verktyg som är tillämpligt på andra embryonala modeller.

Introduction

Genombrott i de molekylära mekanismer som styr genuttryck under embryonal utveckling har gjort det möjligt för oss att förstå hur cellödet bestäms. Engagemang för olika cellinjer sker när celler börjar molekylärt uttryck av transkriptionsfaktorer¹. Detta uttrycksmönster är mycket koordinerat i rum och tid och styr därmed formning, positionering och mönstrande av celler, vävnader och organ 1,2,3,4,5. Embryonal induktion är den process genom vilken celler är engagerade i specifika släkter genom att upprätta hierarkier som begränsar cellernas potential, som till och med inkluderar genereringen av den grundläggande kroppsplanen som sker med Spemann-arrangören ^6,7. Blastopore dorsal lip inducerar en andra embryonal axel i ett värdembryo ^8,9. Idag, med hjälp av ympning och andra klassiska experiment i kombination med molekylära tillvägagångssätt, är det känt att olika transkriptionsfaktorer och tillväxtfaktorer fungerar för att styra embryonal induktion i Spemann-arrangören¹⁰. Således är experimentell manipulation ett viktigt verktyg för att förstå celldifferentiering, morfogenes och mönstrade processer under embryogenesen.

Intressant nog, i embryonala system där vävnadstransplantation är svår eller när inducerarna redan är välkända, används bärare för att leverera molekyler (t.ex. proteiner, kemikalier, toxiner etc.) för att reglera celldifferentiering, morfogenes och till och med mönstran. Ett sådant bärarsystem innefattar implantering av pärlor som blötläggs i en specifik molekyl i någon experimentell modellorganism vid vilken utvecklingstidpunkt som helst för att bestämma effekten av nämnda reagens eller styra differentieringen av nämnda modell. Till exempel, genom att implantera retinsyra (RA) -blötlagda pärlor i kycklingvingens lemknopp, visade Cheryl Tickle et al. (1985) att RA inducerar uttrycket av sonisk igelkott i zonen för polariserande aktivitet (ZPA)^11,12. Samma experimentella strategi användes för att upptäcka att RA kontrollerar asymmetrin hos somiter och celldöd i lemknoppen under sifferutveckling och i andra embryonala extremitetsregioner 13,14,15. Andra faktorer, främst proteiner (t.ex. fibroblasttillväxtfaktorer [FGF], transformerande tillväxtfaktor-beta [TGF-ß]) har använts för att inducera lemmar i tidiga embryons flanker respektive nya siffror i den interdigitala regionen, respektive 16,17,18,19,20,21 . Dessa experiment bevisar kraften och nyttan av denna teknik för att bestämma stadiet av engagemang eller kompetens hos vävnader eller grupper av celler som utsätts för molekylerna.

I detta protokoll fungerade kycklingbenet vid sifferbildningsstadiet som den experimentella modellen för att presentera steg för steg hur man förbereder och implanterar de blötlagda pärlorna. Detta experimentella verktyg är dock inte begränsat till denna applikation utan kan utnyttjas i alla experimentella djurmodeller och vilken tidspunkt som helst in vitro och in vivo för att studera induktion, differentiering, celldöd och mönstran.

Protocol

Denna forskning granskades och godkändes av Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals vid Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexiko). 1. Ägginkubation och embryostaging OBS: Befruktade hönsägg kan erhållas från lokala gårdar. Befruktade Vita Leghorn kycklingägg används oftast. Förvara de nygödslade kycklingäggen vid 15 °C i upp till 1 vecka f?…

Representative Results

Använda blötlagda pärlor för att utvärdera cellbeteende i den embryonala kycklingbenetFör att säkerställa effekten av denna analys måste pärlan placeras konsekvent och exakt på rätt plats; i detta fall den distala mest av den tredje interdigiten under den apikala ektodermala åsen AER (figur 1A). Denna positionering gör det möjligt för molekylen i fråga att sprida sig lika genom den interdigitala vävnaden. Dessutom innehåller zonen under AER odifferenti…

Discussion

Den största fördelen med det experimentella verktyget som beskrivs i detta protokoll är att kunna kontrollera tid och plats för exponeringen för pärlor som blötläggs i en given experimentell molekyl. Att kombinera rätt positionering med exakt utvecklingstiming ger enorma möjligheter att studera celldifferentieringsprocesser. Att utföra dessa experiment i odifferentierad vävnad gör det möjligt att undersöka de första avgörande händelserna i cellulär härstamning. Att till exempel placera en TGFß-blöt …

Materials

Affi-Gel Blue Gel beads	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 beads	Bio-Rad	1400123
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Heparine Sepharose beads	Abcam	ab193268
Petri dish	Nest	705001
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01