Summary

Preparación y cría de insectos axénicos con plántulas cultivadas en tejidos para estudios de interacción entre la microbiota huésped-intestino del escarabajo de la hoja

Published: October 08, 2021
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Summary

Para obtener un insecto axénico, se esteriliza la superficie de su huevo y la larva eclosionada se cría posteriormente con hojas axiénicas. Este método proporciona una forma eficiente para la preparación de insectos axénicos sin administrar antibióticos o desarrollar una dieta artificial, que también se puede aplicar a otros insectos que comen hojas.

Abstract

Los intestinos de los insectos son colonizados por diversas bacterias que pueden afectar profundamente los rasgos fisiológicos del huésped. La introducción de una cepa bacteriana particular en un insecto axénico es un método poderoso para verificar la función microbiana intestinal y dilucidar los mecanismos subyacentes a las interacciones entre microbios intestinales y huéspedes. La administración de antibióticos o la esterilización de las superficies de los huevos son dos métodos comúnmente utilizados para eliminar las bacterias intestinales de los insectos. Sin embargo, además de los posibles efectos adversos de los antibióticos en los insectos, estudios previos indicaron que la alimentación con antibióticos no podía eliminar las bacterias intestinales. Por lo tanto, las dietas artificiales libres de gérmenes generalmente se emplean para mantener los insectos axénicos, que es un proceso tedioso y laborioso que no puede parecerse completamente a los componentes nutricionales de los alimentos naturales. Aquí se describe un protocolo eficiente y simple para preparar y mantener larvas axénicas de un escarabajo de la hoja (Plagiodera versicolora). Específicamente, las superficies de los huevos de escarabajo fueron esterilizadas, después de lo cual se utilizaron hojas de álamo libres de gérmenes para criar larvas axénicas. El estado axénico de los insectos se confirmó aún más a través de ensayos dependientes del cultivo e independientes del cultivo. Colectivamente, al combinar la desinfección de huevos y el cultivo libre de gérmenes, se desarrolló un método eficiente y conveniente para obtener P. versicolora axénico, proporcionando una herramienta fácilmente transferible para otros insectos que comen hojas.

Introduction

Similar a los mamíferos, el tracto digestivo de los insectos es una cavidad para la digestión y absorción de los alimentos. La mayoría de los insectos albergan diversas bacterias comensales que prosperan en sus intestinos y viven de la nutrición suministrada por los huéspedes1. La comunidad comensal intestinal tiene un profundo impacto en múltiples procesos fisiológicos en insectos, incluyendo la digestión y desintoxicación de alimentos 2,3,4, nutrición y desarrollo 5,6,7, defensa contra patógenos y parásitos 8,9,10,11, comunicación química 12,13 y comportamientos14 ,15. Curiosamente, parte de la microbiota intestinal puede ser facultativamente patógena o ser manipulada por patógenos invasores para agravar la infección, lo que indica que las bacterias intestinales pueden ser dañinas en algunos casos 16,17,18. Las bacterias intestinales también pueden servir como un recurso microbiano para aplicaciones biotécnicas y manejo de plagas. Por ejemplo, se utilizaron bacterias que digieren la lignocelulosa de insectos fitófagos y xilófagos para digerir células vegetales para desarrollar biocombustibles19. La dispersión de simbiontes intestinales modificados que expresan moléculas bioactivas es una táctica novedosa y prometedora para controlar las plagas agrícolas y forestales y los mosquitos transmisores de enfermedades infecciosas 19,20,21, que también se puede utilizar para mejorar la aptitud de los insectos beneficiosos22. Por lo tanto, ilustrar cómo se comporta una bacteria intestinal in vivo se considera una prioridad para aprovechar al máximo su función y explotarla aún más para diversas aplicaciones.

Los animales pueden albergar de 1 a >1000 especies microbianas simbióticas en el intestino1. Como resultado, es difícil verificar con precisión cómo funcionan los taxones bacterianos individuales o su ensamblaje dentro de un animal, y si el huésped o sus socios microbianos impulsan una función específica. Por lo tanto, la preparación de larvas axénicas para obtener insectos gnotobióticos por colonización mono o multiespecie es necesaria para investigar la función bacteriana y la interacción con los insectos23. En la actualidad, la administración de cócteles antibióticos y la esterilización de la superficie de los huevos de insectos son métodos comunes para eliminar las bacterias intestinales 14,24,25,26. Sin embargo, las dietas antibióticas no pueden eliminar las bacterias intestinales por completo y tienen un efecto negativo en la fisiología del insecto huésped27,28. En consecuencia, el uso de insectos tratados con antibióticos puede oscurecer las verdaderas capacidades de algunas bacterias intestinales. Afortunadamente, la esterilización superficial de los huevos puede negar este problema23,29, que tiene efectos nulos o insignificantes en los insectos experimentales. Además, las dietas artificiales no pueden parecerse completamente a los alimentos naturales para insectos, y desarrollar una dieta artificial es un proceso costoso y que consume mano de obra30,31.

El escarabajo de la hoja de sauce, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), es una plaga herbácea generalizada que se alimenta principalmente de árboles salicáceos, como sauces (Salix) y álamos (Populus L.) 32,33. Aquí, el escarabajo de la hoja de sauce se utilizó como un insecto representativo que come hojas para desarrollar un protocolo para preparar y criar un insecto libre de gérmenes. Explotamos el cultivo de tejido vegetal para obtener hojas de álamo libres de gérmenes para criar larvas axénicas de P. versicolora a partir de huevos esterilizados. El estado axénico de las larvas de P. versicolora se verificó mediante ensayos dependientes del cultivo e independientes del cultivo. Este protocolo puede mantener insectos axénicos que imitan mejor la condición silvestre que la cría de insectos con una dieta artificial. Más importante aún, este método es conveniente a un costo muy bajo, lo que aumenta la viabilidad de obtener insectos axénicos para futuros estudios de interacción insecto-microbiota intestinal, especialmente para insectos no modelo sin dietas artificiales bien desarrolladas.

Protocol

1. Cría de insectos Mantener la población de P. versicolora en una cámara de crecimiento en la condición de 27 °C y 70 ± 5% de humedad relativa con un fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Colóquelos en cajas de plástico perforadas con papel absorbente húmedo alicatado y aliméntelos con ramas de álamo frescas. Rocíe agua limpia sobre el papel absorbente para mantener la humedad y cambie las ramas cada dos días. Aislar a los adultos para la oviposición de…

Representative Results

Las etapas de la vida de P. versicolora se muestran en la Figura 1. El macho adulto es más pequeño que la hembra adulta (Figura 1A). En el campo, el escarabajo agrupa sus huevos en una hoja; aquí, cuatro huevos se separaron de una hoja (Figura 1B). Los segmentos del tallo del álamo y las plántulas utilizadas para la cría de insectos axénicos se muestran en la Figura 2. El intestino de un…

Discussion

La preparación de larvas libres de gérmenes y la obtención de larvas gnotobióticas mediante la reintroducción de cepas bacterianas específicas son métodos poderosos para dilucidar los mecanismos subyacentes a las interacciones huésped-microbio. Las larvas recién nacidas obtienen la microbiota intestinal de dos maneras principales: transmisión vertical de la madre a la descendencia o adquisición horizontal de los hermanos y el medio ambiente34. El primero puede cumplirse mediante la tran…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31971663) y el Programa de Patrocinio de Jóvenes Científicos de Élite por CAST (2020QNRC001).

Materials

0.22 µm syringe filters Millipore SLGP033RB
1 mg/mL NAA stock solution a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water).
b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water.
c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C.
1.5 mL microcentrifuge tubes Sangon Biotech F600620
10x PBS stock solution Biosharp Life Sciences BL302A
2 M KOH solution Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C.
250 mL and 2,000 mL beakers Shubo sb16455
50 mL sterile syringes Jinta JT0125789
500 mL measuring cylinder Shubo sb1601
50x TAE stock solution a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water.
b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL.
d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.
75% ethanol Xingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA) Solarbio Life Sciences 86-87-3
Absorbing paper 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Agar Coolaber 9002-18-0
Agarose Biowest 111860
Autoclave Panasonic MLS-3781L-PC
Bead-beating homogenizer Jing Xin XM-GTL64
DNA extraction kit MP Biomedicals 116560200
EDTA Saiguo Biotech 1340
Filter paper Jiaojie 70 mm diameter
Gel electrophoresis unit Bio-rad 164-5052
Gel Signal Green nucleic acid dye TsingKe TSJ003
Germ-free poplar seedlings Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) TsingKe TSE101
Growth chamber Ruihua HP400GS-C
LB agar medium a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water.
b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar.
c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C.
Mini centrifuge DRAGONLAB D1008
MS basic medium Coolaber PM1121-50L M0245
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water.
b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter.
c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL.
d. Autoclave for 20 min at 121 °C.
NanoDrop 1000 spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Paintbrush 1 cm width, used to collect the eggs
Parafilm Bemis PM-996
PCR Thermal Cyclers Eppendorf 6331000076
Petri dishes Supin 90 mm diameter
pH meter METTLER TOLEDO FE20
Pipettes 0.2-2 µL Gilson ECS000699
Pipettes 100-1,000 µL Eppendorf 3120000267
Pipettes 20-200 µL Eppendorf 3120000259
Pipettes 2-20 µL Eppendorf 3120000232
Plant tissue culture container Chembase ZP21 240 mL
Plastic box 2.35 L
Potassium hydroxide (KOH) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene Sangon Biotech 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Steel balls 0.25 mm used to grind tissues
Stereomicroscope OLYMPUS SZ61
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd
Trans2K plus II DNA marker Transgene Biotech BM121-01
Tris base Biosharp Life Sciences 1115
Tryptone Thermo Fisher Scientific  LP0037
UV transilluminator Monad Biotech QuickGel 6100
Vortexer Scilogex MX-S
Willow branches Sha Lake Park, Wuhan, China
Willow leaf beetle Huazhong Agricultural University, Wuhan, China
Yeast extract Thermo Fisher Scientific LP0021

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Citer Cet Article
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