Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers
Summary
Um ein axenisches Insekt zu erhalten, wird seine Eioberfläche sterilisiert, und die geschlüpfte Larve wird anschließend mit axenischen Blättern aufgezogen. Diese Methode bietet eine effiziente Möglichkeit für die axenische Insektenvorbereitung, ohne Antibiotika zu verabreichen oder eine künstliche Diät zu entwickeln, die auch auf andere blattfressende Insekten angewendet werden kann.
Abstract
Insektendärme werden von verschiedenen Bakterien besiedelt, die die physiologischen Merkmale des Wirts tiefgreifend beeinflussen können. Die Einführung eines bestimmten Bakterienstamms in ein axenisches Insekt ist eine leistungsstarke Methode, um die mikrobielle Funktion des Darms zu überprüfen und die Mechanismen aufzuklären, die den Interaktionen zwischen Darmmikrobe und Wirt zugrunde liegen. Die Verabreichung von Antibiotika oder die Sterilisation von Eioberflächen sind zwei häufig verwendete Methoden, um Darmbakterien von Insekten zu entfernen. Zusätzlich zu den möglichen nachteiligen Auswirkungen von Antibiotika auf Insekten zeigten frühere Studien, dass die Fütterung von Antibiotika Darmbakterien nicht eliminieren konnte. Daher werden keimfreie künstliche Diäten im Allgemeinen verwendet, um axenische Insekten zu erhalten, was ein langwieriger und arbeitsintensiver Prozess ist, der den Nährstoffkomponenten in natürlichen Lebensmitteln nicht vollständig ähneln kann. Beschrieben wird hier ein effizientes und einfaches Protokoll zur Vorbereitung und Pflege axenischer Larven eines Blattkäfers (Plagiodera versicolora). Insbesondere wurden Oberflächen der Käfereier sterilisiert, woraufhin keimfreie Pappelblätter zur Aufzucht axenischer Larven verwendet wurden. Der axenische Status der Insekten wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays weiter bestätigt. Durch die Kombination von Eierdesinfektion und keimfreier Kultivierung wurde gemeinsam eine effiziente und bequeme Methode entwickelt, um axenische P. versicolora zu erhalten, die ein leicht übertragbares Werkzeug für andere blattfressende Insekten darstellt.
Introduction
Ähnlich wie bei Säugetieren ist der Verdauungstrakt von Insekten eine Höhle für die Nahrungsverdauung und -absorption. Die meisten Insekten beherbergen verschiedene kommensale Bakterien, die in ihren Eingeweiden gedeihen und von der Ernährung leben, die von Wirten1 geliefert wird. Die kommensale Darmgemeinschaft hat einen tiefgreifenden Einfluss auf mehrere physiologische Prozesse bei Insekten, einschließlich Nahrungsverdauung und Entgiftung 2,3,4, Ernährung und Entwicklung 5,6,7, Abwehr von Krankheitserregern und Parasiten 8,9,10,11, chemische Kommunikation 12,13 und Verhalten 14 ,15. Interessanterweise können einige Darmmikrobiota fakultativ pathogen sein oder durch eindringende Krankheitserreger manipuliert werden, um die Infektion zu verschlimmern, was darauf hindeutet, dass Darmbakterien in einigen Fällen schädlich sein können16,17,18. Darmbakterien können auch als mikrobielle Ressource für biotechnische Anwendungen und die Schädlingsbekämpfung dienen. Zum Beispiel wurden lignocelluloseverdauende Bakterien aus phytophagen und xylophagen Insekten verwendet, um Pflanzenzellen für die Entwicklung von Biokraftstoffen zu verdauen19. Die Ausbreitung von technisch hergestellten Darmsymbionten, die bioaktive Moleküle exprimieren, ist eine neuartige und vielversprechende Taktik zur Bekämpfung von land- und forstwirtschaftlichen Schädlingen und Moskitos, die Infektionskrankheiten übertragen 19,20,21, die auch zur Verbesserung der Fitness von Nützlingen eingesetzt werden können 22. Die Veranschaulichung, wie sich ein Darmbakterium in vivo verhält, wird daher als Priorität angesehen, um seine Funktion voll auszuschöpfen und für verschiedene Anwendungen weiter zu nutzen.
Tiere können 1 bis >1000 symbiotische mikrobielle Arten im Darm1 beherbergen. Infolgedessen ist es schwierig, genau zu überprüfen, wie sich einzelne bakterielle Taxa oder ihre Ansammlung in einem Tier verhalten und ob der Wirt oder seine mikrobiellen Partner eine bestimmte Funktion ausüben. Daher ist die Vorbereitung axenischer Larven zur Gewinnung von gnotobiotischen Insekten durch Mono- oder Multispezies-Kolonisation notwendig, um die bakterielle Funktion und Interaktion mit Insektenzu untersuchen 23. Gegenwärtig sind die Verabreichung von Antibiotika-Cocktails und die Sterilisation der Oberfläche von Insekteneiern gängige Methoden, um Darmbakterien zu entfernen 14,24,25,26. Antibiotika-Diäten können Darmbakterien jedoch nicht vollständig eliminieren und wirken sich negativ auf die Insektenphysiologie des Wirtsaus 27,28. Folglich kann die Verwendung von mit Antibiotika behandelten Insekten die wahren Fähigkeiten einiger Darmbakterien verschleiern. Glücklicherweise kann die Oberflächensterilisation von Eiern dieses Problemaufheben 23,29, das keine oder nur zu vernachlässigende Auswirkungen auf experimentelle Insekten hat. Darüber hinaus können künstliche Diäten der natürlichen Insektennahrung nicht vollständig ähneln, und die Entwicklung einer künstlichen Ernährung ist ein kostspieliger und arbeitsintensiver Prozess30,31.
Der Weidenblattkäfer, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), ist ein weit verbreiteter blattfressender Schädling, der sich hauptsächlich von salicaceous Bäumen wie Weiden (Salix) und Pappeln (Populus L.) ernährt. 32,33 Hier wurde der Weidenblattkäfer als repräsentatives blattfressendes Insekt verwendet, um ein Protokoll zur Vorbereitung und Aufzucht eines keimfreien Insekts zu entwickeln. Wir nutzten die pflanzliche Gewebekultur, um keimfreie Pappelblätter zu erhalten, um P. versicolora axenische Larven aus sterilisierten Eiern zu züchten. Der axenische Status von P. versicolora-Larven wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays verifiziert. Dieses Protokoll kann axenische Insekten aufrechterhalten, die den Wildzustand besser nachahmen als Insektenaufzucht mit einer künstlichen Diät. Noch wichtiger ist, dass diese Methode zu sehr niedrigen Kosten geeignet ist, was die Machbarkeit der Gewinnung axenischer Insekten für zukünftige Insekten-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien erhöht, insbesondere für Nicht-Modellinsekten ohne gut entwickelte künstliche Diäten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Herstellung keimfreier Larven und die Gewinnung von gnotobiotischen Larven durch Wiedereinführung spezifischer Bakterienstämme sind leistungsfähige Methoden, um die Mechanismen aufzuklären, die den Wirt-Mikroben-Interaktionen zugrunde liegen. Neu geschlüpfte Larven erhalten Darmmikrobiota auf zwei Arten: vertikale Übertragung von der Mutter auf die Nachkommen oder horizontale Akquisition von Geschwistern und der Umwelt34. Ersteres kann durch elterliche Übertragung auf den Nachwuchs durc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31971663) und dem Young Elite Scientists Sponsorship Program von CAST (2020QNRC001) finanziert.
Materials
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
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| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
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| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
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| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
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| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
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