כדי להשיג חרק אקסני, משטח הביצה שלו מעוקר, והזחל הבוקע גדל לאחר מכן באמצעות עלים אקסניים. שיטה זו מספקת דרך יעילה להכנת חרקים אקסניים מבלי לתת אנטיביוטיקה או לפתח תזונה מלאכותית, אשר ניתן ליישם גם על חרקים אוכלי עלים אחרים.
מעיים של חרקים מיושבים על ידי חיידקים מגוונים שיכולים להשפיע באופן עמוק על התכונות הפיזיולוגיות של הפונדקאי. החדרת זן חיידקי מסוים לחרק אקסני היא שיטה רבת עוצמה לאימות תפקוד המיקרוביאלי של המעיים ולהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין חיידקי המעיים לפונדקאי. מתן אנטיביוטיקה או עיקור משטחי ביצים הן שתי שיטות נפוצות להסרת חיידקי מעיים מחרקים. עם זאת, בנוסף להשפעות השליליות הפוטנציאליות של אנטיביוטיקה על חרקים, מחקרים קודמים הצביעו על כך שהאכלת אנטיביוטיקה לא יכולה לחסל את חיידקי המעיים. לפיכך, דיאטות מלאכותיות ללא חיידקים משמשות בדרך כלל לשמירה על חרקים אקסניים, שהוא תהליך מייגע ועתיר עבודה שאינו יכול להידמות באופן מלא למרכיבים תזונתיים במזון טבעי. מתואר כאן פרוטוקול יעיל ופשוט להכנה ותחזוקה של זחלים אקסניים של חיפושית עלים (Plagiodera versicolora). באופן ספציפי, משטחים של ביצי החיפושית עוקרו, ולאחר מכן עלי צפצפה נטולי חיידקים שימשו לגידול זחלים אקסניים. מעמדם האקסני של החרקים אושש עוד יותר באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. באופן קולקטיבי, על ידי שילוב של חיטוי ביצים וטיפוח ללא חיידקים, פותחה שיטה יעילה ונוחה להשגת P. versicolora אקסני, המספקת כלי הניתן להעברה בקלות לחרקים אוכלי עלים אחרים.
בדומה ליונקים, מערכת העיכול של החרקים היא חלל לעיכול המזון ולספיגתו. רוב החרקים מכילים חיידקים קומנסליים מגוונים שמשגשגים במעיים שלהם וחיים על תזונה המסופקת על ידי פונדקאים1. לקהילת המעיים יש השפעה עמוקה על תהליכים פיזיולוגיים מרובים בחרקים, כולל עיכול מזון וניקוי רעלים 2,3,4, תזונה והתפתחות 5,6,7, הגנה מפני פתוגנים וטפילים 8,9,10,11, תקשורת כימית 12,13 והתנהגויות14 ,15. באופן מסקרן, מיקרוביוטה מסוימת של המעיים יכולה להיות פתוגנית מבחינה פקולטטיבית או להיות מתומרנת על ידי פלישה לפתוגנים כדי להחמיר את הזיהום, מה שמצביע על כך שחיידקי המעיים עלולים להזיק במקרים מסוימיםל-16,17,18. חיידקי המעיים יכולים גם לשמש משאב מיקרוביאלי ליישומים ביוטכניים ולהדברת מזיקים. לדוגמה, חיידקים מעכלי ליגנוצלולוז מחרקים פיטופגוסים וקסילופגוסים שימשו לעיכול תאים צמחיים לפיתוח דלקים ביולוגיים19. פיזורם של סימביונטים מהונדסים במעיים המבטאים מולקולות ביו-אקטיביות הוא טקטיקה חדשנית ומבטיחה לניהול מזיקים חקלאיים וייעוריים ויתושים המשדרים מחלות זיהומיות 19,20,21, שניתן להשתמש בהן גם כדי לשפר את כושרם של חרקים מועילים 22. המחשת האופן שבו חיידק מעיים מתנהג ב-in vivo נחשבת אפוא לעדיפות למנף את תפקודו באופן מלא ולנצל אותו עוד יותר ליישומים שונים.
בעלי חיים יכולים להכיל 1 עד >1000 מינים מיקרוביאליים סימביוטיים במעיים1. כתוצאה מכך, קשה לאמת במדויק כיצד טקסונים חיידקיים בודדים או הרכבתם מתפקדים בתוך בעל חיים, והאם הפונדקאי או שותפיו המיקרוביאליים מניעים פונקציה מסוימת. לכן, הכנת זחלים אקסניים להשגת חרקים גנוטוביוטים על ידי התיישבות חד-מינית או מרובת מינים נחוצה כדי לחקור את תפקוד החיידקים ואת האינטראקציה עם חרקים23. כיום, מתן קוקטיילים אנטיביוטיים ועיקור פני השטח של ביצי חרקים הן שיטות נפוצות להסרת חיידקי המעיים 14,24,25,26. עם זאת, דיאטות אנטיביוטיות אינן יכולות לחסל לחלוטין את חיידקי המעיים ולהשפיע לרעה על הפיזיולוגיה של החרקים המארחים27,28. כתוצאה מכך, השימוש בחרקים שטופלו באנטיביוטיקה עלול לטשטש את היכולות האמיתיות של חלק מחיידקי המעיים. למרבה המזל, עיקור פני השטח של ביצים יכול לשלול את הבעיה הזו23,29, שאין לה השפעות או זניחות על חרקים ניסיוניים. יתר על כן, תזונה מלאכותית אינה יכולה להידמות באופן מלא למזון חרקים טבעי, ופיתוח תזונה מלאכותית הוא תהליך יקר וצורך עבודה30,31.
חיפושית עלי הערבה, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), היא מזיקה אוכלת עלים נפוצה הניזונה בעיקר מעצים סלעיים, כגון ערבות (Salix) וצפצפה (Populus L.) 32,33. כאן, חיפושית עלי הערבה שימשה כחרק אוכל עלים מייצג כדי לפתח פרוטוקול להכנה וגידול של חרק ללא חיידקים. ניצלנו את תרבית הרקמה הצמחית כדי להשיג עלי צפצפה נטולי חיידקים כדי לגדל זחלים אקסניים מסוג P. versicolora מביצים מעוקרות. הסטטוס האקסני של זחלי P. versicolora אומת באמצעות מבחנים תלויי תרבות ובלתי תלויי תרבות. פרוטוקול זה יכול לשמור על חרקים אקסניים המחקים טוב יותר את המצב הפראי מאשר גידול חרקים עם תזונה מלאכותית. חשוב מכך, שיטה זו נוחה בעלות נמוכה מאוד, מה שמגדיל את ההיתכנות של השגת חרקים אקסניים למחקרי אינטראקציה עתידיים בין חרקים למעי מיקרוביוטה, במיוחד עבור חרקים שאינם מודלים ללא תזונה מלאכותית מפותחת היטב.
הכנת זחלים נטולי חיידקים והשגת זחלים גנוטוביוטים על ידי הכנסה מחדש של זני חיידקים ספציפיים הן שיטות רבות עוצמה להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות בין פונדקאי למיקרובים. זחלים שזה עתה בקעו משיגים מיקרוביוטה של המעיים בשתי דרכים עיקריות: העברה אנכית מהאם לצאצאים או רכישה אופקית ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31971663) ותוכנית החסות למדעני עילית צעירים על ידי CAST (2020QNRC001).
0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
75% ethanol | Xingheda trade | ||
α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
Agarose | Biowest | 111860 | |
Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
Plastic box | 2.35 L | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
Vortexer | Scilogex | MX-S | |
Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |