Yaprak Böceğinin Host-Gut Mikrobiyota Etkileşim Çalışmaları için Doku Kültürlü Fidanlarla Aksenik Böceklerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi
Summary
Aksenik bir böcek elde etmek için, yumurta yüzeyi sterilize edilir ve yumurtadan çıkan larva daha sonra aksenik yapraklar kullanılarak yetiştirilir. Bu yöntem, antibiyotik uygulamadan veya diğer yaprak yiyen böceklere de uygulanabilen yapay bir diyet geliştirmeden aksenik böcek preparatı için etkili bir yol sağlar.
Abstract
Böcek bağırsakları, konağın fizyolojik özelliklerini derinden etkileyebilecek çeşitli bakteriler tarafından kolonize edilir. Belirli bir bakteri suşunu aksenik bir böceğe sokmak, bağırsak mikrobiyal fonksiyonunu doğrulamak ve bağırsak mikrobu-konakçı etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir. Antibiyotik uygulamak veya yumurta yüzeylerini sterilize etmek, bağırsak bakterilerini böceklerden uzaklaştırmak için yaygın olarak kullanılan iki yöntemdir. Bununla birlikte, antibiyotiklerin böcekler üzerindeki potansiyel olumsuz etkilerine ek olarak, önceki çalışmalar, beslenme antibiyotiklerinin bağırsak bakterilerini ortadan kaldıramayacağını göstermiştir. Bu nedenle, mikropsuz yapay diyetler genellikle doğal gıdalardaki besin bileşenlerine tam olarak benzeyemeyen sıkıcı ve emek yoğun bir süreç olan aksenik böcekleri korumak için kullanılır. Burada tarif edilen, bir yaprak böceğinin (Plagiodera versicolora) aksenik larvalarını hazırlamak ve sürdürmek için etkili ve basit bir protokoldür. Spesifik olarak, böcek yumurtalarının yüzeyleri sterilize edildi, ardından aksenik larvaları desteklemek için mikropsuz kavak yaprakları kullanıldı. Böceklerin aksenik durumu, kültüre bağımlı ve kültürden bağımsız analizlerle daha da doğrulandı. Toplu olarak, yumurta dezenfeksiyonu ve mikropsuz yetiştiriciliği birleştirerek, diğer yaprak yiyen böcekler için kolayca aktarılabilir bir araç sağlayan aksenik P. versicolora elde etmek için verimli ve uygun bir yöntem geliştirilmiştir.
Introduction
Memelilere benzer şekilde, böcek sindirim sistemi, gıda sindirimi ve emilimi için bir boşluktur. Çoğu böcek, bağırsaklarında gelişen ve konakçılar tarafından sağlanan beslenmeyle yaşayan çeşitli kommensal bakterileri barındırır1. Bağırsak komensal topluluğu, gıda sindirimi ve detoksifikasyonu 2,3,4, beslenme ve gelişme 5,6,7, patojenlere ve parazitlere karşı savunma 8,9,10,11, kimyasal iletişim 12,13 ve davranışlar 14 dahil olmak üzere böceklerdeki çoklu fizyolojik süreçler üzerinde derin bir etkiye sahiptir. ,15. İlginçtir ki, bazı bağırsak mikrobiyotaları fakültatif olarak patojenik olabilir veya enfeksiyonu şiddetlendirmek için patojenleri istila ederek manipüle edilebilir, bu da bağırsak bakterilerinin bazı durumlarda zararlı olabileceğini gösterir16,17,18. Bağırsak bakterileri ayrıca biyoteknik uygulamalar ve haşere yönetimi için mikrobiyal bir kaynak olarak da hizmet edebilir. Örneğin, fitofajlı ve ksilofajik böceklerden gelen lignoselüloz sindiren bakteriler, biyoyakıt geliştirmek için bitki hücrelerini sindirmek için kullanılmıştır19. Biyoaktif molekülleri ifade eden mühendislik ürünü bağırsak simbiyontlarının dağılımı, tarım ve ormancılık zararlılarını ve bulaşıcı hastalıkları ileten sivrisinekleri yönetmek için yeni ve umut verici bir taktiktir 19,20,21, faydalı böceklerin uygunluğunu artırmak için de kullanılabilir 22. Bir bağırsak bakterisinin in vivo olarak nasıl davrandığını göstermek, işlevini tam olarak kullanmak ve çeşitli uygulamalar için daha fazla kullanmak için bir öncelik olarak kabul edilir.
Hayvanlar bağırsakta 1 ila 1000 > simbiyotik mikrobiyal türbarındırabilir 1. Sonuç olarak, bireysel bakteri taksonlarının veya montajlarının bir hayvanın içinde nasıl performans gösterdiğini ve konakçının veya mikrobiyal ortaklarının belirli bir işlevi sürdürüp sürdürmediğini doğru bir şekilde doğrulamak zordur. Bu nedenle, mono- veya çok türlü kolonizasyon yoluyla gnotobiyotik böcekler elde etmek için aksenik larvaların hazırlanması, bakteriyel fonksiyonu ve böceklerle etkileşimi araştırmak için gereklidir23. Şu anda, antibiyotik kokteyllerinin uygulanması ve böcek yumurtalarının yüzeyinin sterilize edilmesi, bağırsak bakterilerini gidermek için yaygın yöntemlerdir 14,24,25,26. Ancak antibiyotik diyetleri bağırsak bakterilerini tamamen yok edememekte ve konakçı böcek fizyolojisi üzerinde olumsuz etki yaratmaktadır27,28. Sonuç olarak, antibiyotik ile tedavi edilen böceklerin kullanımı, bazı bağırsak bakterilerinin gerçek yeteneklerini gizleyebilir. Neyse ki, yumurtaların yüzey sterilizasyonu, deneysel böcekler üzerinde hiçbir etkisi olmayan veya ihmal edilebilir etkileri olan bu sorunu23,29 olumsuzlayabilir. Ayrıca, yapay diyetler doğal böcek gıdalarına tam olarak benzeyemez ve yapay bir diyet geliştirmek maliyetli ve emek tüketen bir süreçtir30,31.
Söğüt yaprağı böceği, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), esas olarak söğütler (Salix) ve kavak (Populus L.) gibi tuzlu ağaçlarla beslenen yaygın bir yaprak yiyen zararlıdır. 32,33. Burada, söğüt yaprağı böceği, mikropsuz bir böceği hazırlamak ve yetiştirmek için bir protokol geliştirmek için temsili bir yaprak yiyen böcek olarak kullanılmıştır. Sterilize edilmiş yumurtalardan P. versicolora aksenik larvalarını arkaya doğru mikropsuz kavak yaprakları elde etmek için bitki doku kültüründen yararlandık. P. versicolora larvalarının aksenik durumu, kültüre bağımlı ve kültürden bağımsız tahlillerle doğrulandı. Bu protokol, vahşi durumu yapay bir diyetle böcek yetiştirmekten daha iyi taklit eden aksenik böcekleri koruyabilir. Daha da önemlisi, bu yöntem çok düşük bir maliyetle uygundur, bu da gelecekteki böcek-bağırsak mikrobiyota etkileşim çalışmaları için, özellikle de iyi gelişmiş yapay diyetler içermeyen model olmayan böcekler için aksenik böceklerin elde edilmesinin fizibilitesini arttırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikropsuz larvaların hazırlanması ve spesifik bakteri suşlarının yeniden sokulmasıyla gnotobiyotik larvaların elde edilmesi, konakçı-mikrop etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için güçlü yöntemlerdir. Yeni yumurtadan çıkan larvalar bağırsak mikrobiyotasını iki ana yolla elde eder: anneden yavrulara dikey geçiş veya kardeşlerden yatay edinim ve çevre34. İlki, yumurta yüzeyinin kirlenmesi yoluyla yavrulara ebeveyn transferi ile yerine getirilebilir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31971663) ve CAST (2020QNRC001) tarafından Genç Elit Bilim İnsanları Sponsorluk Programı tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 0.22 µm syringe filters | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA stock solution | a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 µm syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 °C. |
||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS stock solution | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH solution | Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 °C. | ||
| 250 mL and 2,000 mL beakers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL sterile syringes | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL measuring cylinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE stock solution | a. Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. c. Adjust the final volume to 1,000 mL. d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used. |
||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naphthalene acetic acid (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbing paper | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclave | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Bead-beating homogenizer | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA extraction kit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filter paper | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gel electrophoresis unit | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signal Green nucleic acid dye | TsingKe | TSJ003 | |
| Germ-free poplar seedlings | Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1.1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Growth chamber | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB agar medium | a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. c. Autoclave the medium for 20 min at 121 °C. |
||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basic medium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS solid medium for germ-free poplar seedling culture | a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. d. Autoclave for 20 min at 121 °C. |
||
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Paintbrush | 1 cm width, used to collect the eggs | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermal Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petri dishes | Supin | 90 mm diameter | |
| pH meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipettes 0.2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipettes 100-1,000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipettes 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipettes 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plant tissue culture container | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Plastic box | 2.35 L | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Steel balls | 0.25 mm | used to grind tissues | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Biosharp Life Sciences | 1115 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
| UV transilluminator | Monad Biotech | QuickGel 6100 | |
| Vortexer | Scilogex | MX-S | |
| Willow branches | Sha Lake Park, Wuhan, China | ||
| Willow leaf beetle | Huazhong Agricultural University, Wuhan, China | ||
| Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | LP0021 |
References
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Tokuda, G., et al. Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Shin, S. C., et al. Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling. Science. 334 (6056), 670-674 (2011).
- Storelli, G., et al. Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing. Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).
- Salem, H., et al. Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host. Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).
- Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).
- Cirimotich, C. M., et al. Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae. Science. 332 (6031), 855-858 (2011).
- Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation. Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).
- Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera. Insect Science. , (2021).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. Pheromones – Exploitation of gut bacteria in the locust. Nature. 403 (6772), 851 (2000).
- Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production. Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
- Jia, Y., et al. Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling. Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Xu, L., et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle. Microbiome. 9 (1), 98 (2021).
- Xu, L., et al. Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality. Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).
- Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. Potential applications of insect symbionts in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).
- Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a ‘Trojan Horse’ for paratransgenesis in termites. BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).
- Wang, S., et al. Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Berasategui, A., et al. Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness. Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).
- Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).
- Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).
- Bengtson, D. A. A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).
- Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant. Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).
- Ishihara, M., Ohgushi, T. Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae). Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).
- Bright, M., Bulgheresi, S. A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Hosokawa, T., et al. Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations. Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).
- Habineza, P., et al. The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism. Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).
- Meilan, R., Ma, C. Poplar (Populus spp.). Methods in Molecular Biology. 344, 143-151 (2006).
- Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).
- Grout, B. W. Meristem-tip culture. Methods in Molecular Biology. 6, 81-91 (1990).
