Dans ce protocole, les points quantiques conjugués au pic recombinant du SARS-CoV-2 permettent aux tests cellulaires de surveiller la liaison du pic à hACE2 au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose ultérieure des protéines liées dans le cytoplasme.
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Article de méthode
Imagerie confocale à haut débit des trimères de pointes SRAS-CoV-2 conjuguées aux points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose dans les cellules HEK293T
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement de nouvelles technologies pour la microscopie à fluorescence cellulaire a facilité les méthodes de criblage à haut débit pour la découverte de médicaments. Les points quantiques sont des nanoparticules fluorescentes avec d’excellentes propriétés photophysiques imprégnées d’une photoluminescence brillante et stable ainsi que de bandes d’émission étroites. Les points quantiques sont de forme sphérique et, avec la modification appropriée de la chimie de surface, peuvent être utilisés pour conjuguer des biomolécules pour des applications cellulaires. Ces propriétés optiques, combinées à la capacité de les fonctionnaliser avec des biomolécules, en font un excellent outil pour étudier les interactions récepteur-ligand et le trafic cellulaire. Ici, nous présentons une méthode qui utilise des points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. Ce protocole peut être utilisé comme guide pour les expérimentateurs qui cherchent à utiliser des points quantiques pour étudier les interactions et le trafic protéine-protéine dans le contexte de la physiologie cellulaire.
Introduction
La microscopie à fluorescence permet aux chercheurs d’examiner le fonctionnement interne de la cellule à l’aide de colorants spécialisés1, de protéines fluorescentes génétiquement codées2 et de nanoparticules fluorescentes sous forme de points quantiques (QD)3. Pour la pandémie mondiale du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère de 2019 (SARS-CoV-2), les chercheurs ont utilisé la microscopie à fluorescence pour comprendre comment le virus interagit avec la cellule à la fois au niveau de la membrane plasmique et du cytoplasme. Par exemple, les chercheurs ont pu mieux comprendre la liaison ....
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Protocole
La lignée cellulaire HEK293T utilisée dans cette étude est une lignée cellulaire immortalisée. Aucun sujet humain ou animal n’a été utilisé dans cette étude.
1. Culture et ensemencement cellulaire
- À l’intérieur d’une armoire stérile de biosécurité, en portant de l’équipement de protection individuelle (y compris des gants de laboratoire, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité), préparez le milieu de culture cellulaire en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) et 250 μg/mL de G418.
- Pour 500 mL de média....
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Résultats
Après le traitement, les QD seront internalisés car la nanoparticule se liera à ACE2 sur la membrane plasmique et induira une endocytose. À l’aide d’une lignée cellulaire exprimant ACE2-GFP, la translocation des QD et de l’ACE2 peut être visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence. Une fois internalisés, les deux signaux QD et ACE2 montrent une forte colocalisation. À partir de ces images, la segmentation de l’image et l’analyse ultérieure peuvent être effectuées pour extraire des paramètres pertinents tels que .......
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Discussion
La méthode décrite dans cet article fournit les étapes nécessaires pour l’imagerie de QD fonctionnalisés dans des cellules humaines à l’aide de la microscopie confocale à haut débit. Cette méthode convient mieux aux cellules où l’endocytose est la principale voie d’entrée virale plutôt que l’activité de TMPRSS2 et de fusion membranaire, car elle permet d’étudier le PIC SARS-CoV-2 et l’endocytose hACE2. En raison de la nature du modèle QD et de l’étiquette His-terminal C sur le trimer Spike disponible dans le commerce, to.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été soutenue en partie par le programme de recherche intra-muros du National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Le Naval Research Laboratory a fourni un financement par l’intermédiaire de son Institut interne de nanosciences. La préparation des réactifs a été soutenue par le fonds de base NRL COVID-19.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscopie électronique | paraformaldéhyde à 32 % | 15714 | Utilisé pour la fixation des cellules après traitement par points quantiques, concentration finale 3,2 % Utilisé pour stabiliser les QD dans Optimem I et prévenir les interactions non spécifiques, concentration finale 0,1 % |
| 7,5 % Albumine sérique bovine | Gibco | 15260-037 | Utilisé comme colorant de viabilité cellulaire pour le comptage cellulaire en fluorescence |
| Colorant orange acridine / iodure de propidium | Logos Biosystems | F23001 | Plaques micropuits utilisées pour l’ensemencement de cellules et le dosage QD-Spike |
| Noir fond transparent 96 Plaque bien enduite recouverte de poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Utilisée pour soutenir la culture cellulaire, supplément de DMEM |
| Sérum de veau fœtal caractérisé | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Logiciel d’analyse d’images à haut contenu basé sur le cloud ; V2.9.1 |
| Analyseur Columbus | Perkin Elmer | NA | Utilisé pour le marquage des noyaux cellulaires et des corps cellulaires après fixation, colorant nucléaire rouge foncé |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Milieu de base pour la culture cellulaire HEK293T |
| Dulbecco’s Minimal Essential Media, D-glucose (4,5 g/L), L-glutamine, pyruvate de sodium (110 mg/L), rouge de phénol | Gibco | 11995-065 | Utilisé pour organiser les données après l’exportation de Columbus ; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Utilisé pour poursuivre la sélection de cellules positives hACE2-GFP, supplément DMEM |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine expression stable enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 étiqueté avec GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Compteur de cellules automatisé |
| Luna Compteur de cellules automatisé | Logos Biosystems | NA | Utilisé pour le comptage de cellules par fluorescence |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | Plate-forme d’imagerie à haut contenu |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Média d’imagerie, utilisé pour l’incubation de cellules à l’aide de points quantiques |
| Opti-MEM I Sérum réduit | Medium Gibco | 11058-021 | Solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium utilisée pour le lavage des cellules pendant le passage et |
| le dosage PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Utilisé pour prévenir la contamination bactérienne de la culture cellulaire, supplément de DMEM |
| Pénicilline Streptomycine | Gibco | 15140-122 | Utilisé pour la représentation graphique, la visualisation des données et l’analyse statistique ; V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Utilisé pour le dosage de la liaison du Spike du SARS-Cov-2 à hACE2 et le suivi de l’endocytose du Spike |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | fabriqué sur mesure par le Naval Research Laboratory | Utilisé pour l’inhibition de la liaison du Spike du SARS-Cov-2 à hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Utilisé pour dissocier les cellules du ballon pendant |
| le passage TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
Références
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors t....
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Réimpressions et autorisations
