Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen
Summary
In dit protocol stellen quantum dots geconjugeerd aan recombinant SARS-CoV-2 spike celgebaseerde assays in staat om spikebinding aan hACE2 aan het plasmamembraan en daaropvolgende endocytose van de gebonden eiwitten in het cytoplasma te controleren.
Abstract
De ontwikkeling van nieuwe technologieën voor cellulaire fluorescentiemicroscopie heeft screeningmethoden met hoge doorvoer voor het ontdekken van geneesmiddelen vergemakkelijkt. Quantum dots zijn fluorescerende nanodeeltjes met uitstekende fotofysische eigenschappen doordrenkt met heldere en stabiele fotoluminescentie en smalle emissiebanden. Quantum dots zijn bolvormig en kunnen met de juiste modificatie van de oppervlaktechemie worden gebruikt om biomoleculen te conjugeren voor cellulaire toepassingen. Deze optische eigenschappen, gecombineerd met het vermogen om ze te functionaliseren met biomoleculen, maken ze een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van receptor-ligandinteracties en cellulaire handel. Hier presenteren we een methode die quantum dots gebruikt om de binding en endocytose van SARS-CoV-2 spike-eiwit te volgen. Dit protocol kan worden gebruikt als een gids voor experimentalisten die quantum dots willen gebruiken om eiwit-eiwitinteracties en mensenhandel te bestuderen in de context van cellulaire fysiologie.
Introduction
Fluorescentiemicroscopie stelt onderzoekers in staat om in de innerlijke werking van de cel te kijken met behulp van gespecialiseerde kleurstoffen1, genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten2 en fluorescerende nanodeeltjes in de vorm van quantum dots (QDs)3. Voor de wereldwijde pandemie van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus van 2019 (SARS-CoV-2) hebben onderzoekers fluorescentiemicroscopie gebruikt om te begrijpen hoe het virus interageert met de cel, zowel bij het plasmamembraan als in het cytoplasma. Onderzoekers hebben bijvoorbeeld inzicht kunnen krijgen in de binding van het SARS-CoV-2 Spike-eiwit op het oppervlak van het virion aan het menselijke angiotensine-converterende enzym 2 (hACE2) op het oppervlak van menselijke cellen, daaropvolgende internalisatie via fusie aan het plasmamembraan en endocytose van het Spike: hACE2-eiwitcomplex4,5. Er zijn ook geweldige inzichten verkregen in de SARS-CoV-2-uitgang van cellen via het lysosoom met behulp van cellulaire fluorescentiebeeldvorming, een uniek kenmerk van coronavirussen waarvan eerder werd gedacht dat ze optraden via traditionele blaasjes die ontluiken uit de Golgi, zoals het is met veel andere virussen6. Een steunpilaar van bijna alle aspecten van biologisch onderzoek, de cellulaire fluorescentiemicroscopietechniek is noodzakelijkerwijs gevorderd in zijn breedte en toepassingsgebied van superresolutie beeldvorming van hele dieren tot geautomatiseerde multi-parametrische beeldvorming met een hoog gehalte voor geneesmiddelenscreening. Hier wordt geautomatiseerde confocale microscopie met een hoog gehalte toegepast op de studie van SARS-CoV-2-celinvoer met behulp van fluorescerende QD’s geconjugeerd aan het virale spike-eiwit.
High-content analyse van beelden gegenereerd door biologische beeldvormingsplatforms maakt een grotere extractie van waardevolle biologische inzichten mogelijk dan afzonderlijke parameters zoals de intensiteit van de hele put, die men zou verkrijgen met behulp van een multimodale plaatlezer7. Door de objecten in een gezichtsveld te scheiden met behulp van geautomatiseerde segmentatiealgoritmen, kan elk object of een populatie objecten worden geanalyseerd op parameters zoals intensiteit, oppervlakte en textuur in elk beschikbaar fluorescentiekanaal8. Het combineren van veel metingen in multivariate datasets is een nuttige benadering voor fenotypische profilering. Wanneer het gewenste fenotype bekend is, zoals QD-internalisatie in de vorm van puncta, kan men de metingen met betrekking tot puncta zoals grootte, aantal en intensiteit gebruiken om de werkzaamheid van een behandeling te beoordelen.
Cloudgebaseerde high content imaging-analysesoftware is geschikt voor een grote verscheidenheid aan instrumentgegevensuitvoer, waaronder het high content imaging-platform. Door een cloudgebaseerde server te gebruiken voor beeldopslag en online analyse, kan de gebruiker zijn gegevens uploaden vanaf het beeldvormingsinstrument of vanaf de netwerkschijf waar de gegevens zijn opgeslagen. Het analysegedeelte van het protocol wordt uitgevoerd binnen de cloudsoftwareomgeving en gegevens kunnen in verschillende bestandsindelingen worden geëxporteerd voor downstream-gegevensvisualisatie.
Het SARS-CoV-2-virus bestaat uit niet-structurele en structurele eiwitten die helpen bij de assemblage en replicatie ervan. SARS-CoV-2-piek heeft twee domeinen genaamd S1 en S2, waarbij S1 het receptorbindende domein bevat dat verantwoordelijk is voor hACE2-interacties bij het plasmamembraan9. Spike blijkt ook te interageren met andere moleculen in het plasmamembraan die naast hACE210,11 als co-receptoren kunnen fungeren. Gedurende de spike-eiwitsequentie en met name op de S1/S2-interface zijn er proteasesplitsingsplaatsen die fusie op het membraan mogelijk maken na het transmembraan serineprotease 2 (TMPRSS2)12. Verschillende recombinante SARS-CoV-2 Spike-eiwitten zijn geproduceerd uit individuele receptorbindende domeinen, tot S1, S2, S1 met S2 en hele spike trimers van meerdere commerciële leveranciers voor gebruik in onderzoeksactiviteiten13.
In dit werk werd het oppervlak van QD’s gefunctionaliseerd met recombinante spike trimers die een histidine tag (QD-Spike) bevatten. De QD’s geproduceerd door Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section bevatten een cadmiumselenidekern en een zinksulfideschaal14,15. Het zink op het QD-oppervlak coördineert de histidineresiduen in het recombinante eiwit om een gefunctionaliseerde QD te vormen die qua vorm en functie lijkt op een SARS-CoV-2-virusdeeltje. De generatie van de nanodeeltjes en eiwitconjugatie werd eerder beschreven met behulp van het QD-geconjugeerde receptorbindingsdomein15. Deze methode beschrijft de celkweekpreparaten, QD-behandeling, beeldacquisitie en data-analyseprotocol dat een onderzoeker kan begeleiden bij het bestuderen van SARS-CoV-2 Spike-activiteit in de fysiologische context van een menselijke cel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode die in dit artikel wordt beschreven, biedt de nodige stappen voor het in beeld brengen van gefunctionaliseerde QD’s in menselijke cellen met behulp van confocale microscopie met hoge doorvoer. Deze methode is het meest geschikt voor cellen waar endocytose de belangrijkste route van virale binnenkomst is in plaats van de activiteit van TMPRSS2 en membraanfusie, omdat het de studie van SARS-CoV-2 Spike en hACE2 endocytose mogelijk maakt. Vanwege de aard van het QD-model en de C-terminal His-tag op de in de hande…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory verstrekte financiering via zijn interne Nanoscience Institute. Reagensvoorbereiding werd ondersteund via het NRL COVID-19-basisfonds.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
