Konfektavbildning av Quantum Dot-Konjugert SARS-CoV-2 spike trimers for å spore binding og endokytose i HEK293T-celler
Summary
I denne protokollen, kvanteprikker konjugert til rekombinant SARS-CoV-2 spike aktivere cellebaserte analyser for å overvåke spike binding til hACE2 ved plasmamembranen og påfølgende endokytose av de bundne proteiner i cytoplasma.
Abstract
Utviklingen av ny teknologi for cellulær fluorescensmikroskopi har lagt til rette for screeningmetoder med høy gjennomstrømning for narkotikaoppdagelse. Kvanteprikker er fluorescerende nanopartikler med utmerkede fotofysiske egenskaper gjennomsyret av lys og stabil fotoluminescens samt smale utslippsbånd. Kvanteprikke er sfæriske i form, og med riktig modifikasjon av overflatekjemien kan brukes til å konjugere biomolekyler for cellulære applikasjoner. Disse optiske egenskapene, kombinert med evnen til å funksjonalisere dem med biomolekyler, gjør dem til et utmerket verktøy for å undersøke reseptor-ligand interaksjoner og cellulær menneskehandel. Her presenterer vi en metode som bruker kvanteprikker for å spore binding og endokytose av SARS-CoV-2 spike protein. Denne protokollen kan brukes som en veiledning for eksperimentalister som ønsker å bruke kvanteprikkene til å studere proteinproteininteraksjoner og menneskehandel i sammenheng med cellulær fysiologi.
Introduction
Fluorescensmikroskopi gjør det mulig for forskere å kikke inn i cellens indre arbeid ved hjelp av spesialiserte fargestoffer1, genetisk kodede fluorescerende proteiner2 og fluorescerende nanopartikler i form av kvanteprikker (QDs)3. For det alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus i 2019 (SARS-CoV-2) global pandemi, har forskere brukt fluorescensmikroskopi for å forstå hvordan viruset samhandler med cellen både ved plasmamembranen og i cytoplasma. For eksempel har forskere vært i stand til å få innsikt i bindingen av SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virionens overflate til menneskelig angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) på overflaten av menneskelige celler, etterfølgende internalisering via fusjon ved plasmamembranen og endokytose av Spike:hACE2 proteinkomplekset4,5. Stor innsikt har også blitt oppnådd i SARS-CoV-2-utgående fra celler via lysosomet ved hjelp av cellulær fluorescensavbildning, et unikt trekk ved koronavirus som tidligere ble antatt å oppstå via tradisjonell vesicle spirende fra Golgi, som det er med mange andre virus6. En bærebjelke i nesten alle aspekter av biologisk forskning, den cellulære fluorescensmikroskopiteknikken har nødvendigvis avansert i bredden og omfanget av applikasjoner fra superoppløselig avbildning av hele dyr til automatisert multiparametrisk bildebehandling med høyt innhold for narkotikascreening. Her brukes automatisert konfektmikroskopi med høyt innhold på studiet av SARS-CoV-2-celleinngang ved hjelp av fluorescerende QDer som er konjugert til det virale piggproteinet.
Høyinnholdsanalyse av bilder generert av biologiske bildeplattformer gir større utvinning av verdifull biologisk innsikt enn enkeltparametere som hel brønnintensitet, som man vil oppnå ved hjelp av en multimodal plateleser7. Ved å skille objektene i et synsfelt ved hjelp av automatiserte segmenteringsalgoritmer, kan hvert objekt eller en populasjon av objekter analyseres for parametere som intensitet, område og tekstur i hver tilgjengelige fluorescenskanal8. Å kombinere mange målinger i multivariate datasett er en nyttig tilnærming for fenotypisk profilering. Når ønsket fenotype er kjent, for eksempel QD internalisering i form av puncta, kan man bruke målingene relatert til puncta som størrelse, antall og intensitet for å vurdere effekten av en behandling.
Skybasert programvare for bildebehandling med høyt innhold kan romme et stort utvalg av instrumentdatautganger, inkludert bildeplattformen med høyt innhold. Ved å bruke en skybasert server for bildelagring og online analyse, kan brukeren laste opp dataene sine fra enten bildeinstrumentet eller fra nettverksstasjonen der dataene er lagret. Analysedelen av protokollen utføres i skyprogramvaremiljøet, og data kan eksporteres i en rekke filformater for nedstrøms datavisualisering.
SARS-CoV-2-viruset består av ikke-strukturelle og strukturelle proteiner som hjelper til med montering og replikering. SARS-CoV-2 spike har to domener kalt S1 og S2, med S1 som inneholder reseptorbindingsdomenet som er ansvarlig for hACE2-interaksjoner ved plasmamembranen9. Spike har også vist seg å samhandle med andre molekyler ved plasmamembranen som kan fungere som koreseptorer i tillegg til hACE210,11. Gjennom piggproteinsekvensen og spesielt ved S1/S2-grensesnittet er det protease spaltingssteder som muliggjør fusjon ved membranen etter transmembrane serinprotease 2 (TMPRSS2)12. Ulike rekombinante SARS-CoV-2 Spike-proteiner er produsert fra individuelle reseptorbindingsdomener, til S1, S2, S1 med S2 og hele spike trimers fra flere kommersielle leverandører for bruk i forskningsaktiviteter13.
I dette arbeidet ble overflaten av QDs funksjonalisert med rekombinante spike trimers som inneholder en histidin tag (QD-Spike). QD-ene produsert av Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section inneholder en kadmium selenidkjerne og et sinksulfidskall14,15. Sinken på QD-overflaten koordinerer histidinrester i det rekombinante proteinet for å danne en funksjonalisert QD som ligner en SARS-CoV-2 viral partikkel i form og funksjon. Genereringen av nanopartikler og proteinkonjugering ble tidligere beskrevet ved hjelp av QD-konjugert reseptorbindingsdomene15. Denne metoden beskriver cellekulturpreparatene, QD-behandling, bildeinnhenting og dataanalyseprotokoll som kan veilede en forsker i å studere SARS-CoV-2 Spike-aktivitet i den fysiologiske konteksten til en menneskelig celle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som er beskrevet i denne artikkelen, inneholder de nødvendige trinnene for avbildning av funksjonaliserte QDer i humane celler ved hjelp av konfektmikroskopi med høy gjennomstrømning. Denne metoden er best egnet for celler der endokytose er hovedveien for viral oppføring i stedet for aktiviteten til TMPRSS2 og membranfusjon, da den muliggjør studiet av SARS-CoV-2 Spike og hACE2 endokytose. På grunn av arten av QD-modellen og C-terminalen His-tag på den kommersielt tilgjengelige Spike trimer, vil enhver TMP…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble delvis støttet av Intramural Research Program ved National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory ga støtte via sitt interne Nanoscience Institute. Reagensforberedelse ble støttet via NRL COVID-19 basisfond.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
