Imaging confocale ad alto rendimento di trimeri spike SARS-CoV-2 coniugati quantum dot per tracciare il legame e l'endocitosi nelle cellule HEK293T
Summary
In questo protocollo, i punti quantici coniugati al picco RICOMBINANTE SARS-CoV-2 consentono saggi basati su cellule per monitorare il legame dello spike a hACE2 sulla membrana plasmatica e la successiva endocitosi delle proteine legate nel citoplasma.
Abstract
Lo sviluppo di nuove tecnologie per la microscopia a fluorescenza cellulare ha facilitato i metodi di screening ad alto rendimento per la scoperta di farmaci. I punti quantici sono nanoparticelle fluorescenti con eccellenti proprietà fotofisiche intrise di fotoluminescenza luminosa e stabile e bande di emissione strette. I punti quantici sono di forma sferica e, con la corretta modifica della chimica superficiale, possono essere utilizzati per coniugare biomolecole per applicazioni cellulari. Queste proprietà ottiche, unite alla capacità di funzionalizzarle con biomolecole, le rendono un ottimo strumento per studiare le interazioni recettore-ligando e il traffico cellulare. Qui, presentiamo un metodo che utilizza punti quantici per tracciare il legame e l’endocitosi della proteina spike SARS-CoV-2. Questo protocollo può essere utilizzato come guida per gli sperimentatori che cercano di utilizzare i punti quantici per studiare le interazioni proteina-proteina e il traffico nel contesto della fisiologia cellulare.
Introduction
La microscopia a fluorescenza consente ai ricercatori di scrutare il funzionamento interno della cellula utilizzando coloranti specializzati1, proteine fluorescenti geneticamente codificate2 e nanoparticelle fluorescenti sotto forma di punti quantici (QD)3. Per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus della pandemia globale del 2019 (SARS-CoV-2), i ricercatori hanno impiegato la microscopia a fluorescenza per capire come il virus interagisce con la cellula sia sulla membrana plasmatica che nel citoplasma. Ad esempio, i ricercatori sono stati in grado di ottenere informazioni sul legame della proteina Spike SARS-CoV-2 sulla superficie del virione all’enzima umano di conversione dell’angiotensina 2 (hACE2) sulla superficie delle cellule umane, sulla successiva internalizzazione tramite fusione alla membrana plasmatica e sull’endocitosi del complesso proteico Spike:hACE24,5. Sono state acquisite anche grandi intuizioni sull’uscita di SARS-CoV-2 dalle cellule attraverso il lisosoma utilizzando l’imaging a fluorescenza cellulare, una caratteristica unica dei coronavirus precedentemente ritenuta verificarsi tramite vescicole tradizionali in erba dal Golgi, come è con molti altri virus6. Un pilastro di quasi tutti gli aspetti della ricerca biologica, la tecnica di microscopia a fluorescenza cellulare è necessariamente avanzata nella sua ampiezza e portata di applicazioni dall’imaging a super-risoluzione di animali interi all’imaging multiparametrico automatizzato ad alto contenuto per lo screening dei farmaci. Qui, la microscopia confocale automatizzata ad alto contenuto viene applicata allo studio dell’ingresso delle cellule SARS-CoV-2 utilizzando QD fluorescenti coniugati alla proteina spike virale.
L’analisi ad alto contenuto delle immagini generate da piattaforme di imaging biologico consente una maggiore estrazione di preziose informazioni biologiche rispetto a singoli parametri come l’intensità del pozzo intero, che si otterrebbe utilizzando un lettore di lastre multimodale7. Separando gli oggetti in un campo visivo utilizzando algoritmi di segmentazione automatizzati, ogni oggetto o una popolazione di oggetti può essere analizzato per parametri quali intensità, area e trama in ciascun canale di fluorescenza disponibile8. La combinazione di molte misurazioni in set di dati multivariati è un approccio utile per la profilazione fenotipica. Quando il fenotipo desiderato è noto, come l’internalizzazione QD sotto forma di puncta, è possibile utilizzare le misurazioni relative al puncta come dimensioni, numero e intensità per valutare l’efficacia di un trattamento.
Il software di analisi di imaging ad alto contenuto basato su cloud può ospitare un’ampia varietà di output di dati strumentali, inclusa la piattaforma di imaging ad alto contenuto. Utilizzando un server basato su cloud per l’archiviazione delle immagini e l’analisi online, l’utente è in grado di caricare i propri dati dallo strumento di imaging o dall’unità di rete in cui sono archiviati i dati. La parte di analisi del protocollo viene condotta all’interno dell’ambiente software cloud e i dati possono essere esportati in una varietà di formati di file per la visualizzazione dei dati a valle.
Il virus SARS-CoV-2 è composto da proteine non strutturali e strutturali che aiutano nel suo assemblaggio e replicazione. Lo spike SARS-CoV-2 ha due domini chiamati S1 e S2, con S1 contenente il dominio di legame del recettore responsabile delle interazioni hACE2 sulla membrana plasmatica9. Spike è stato anche trovato per interagire con altre molecole sulla membrana plasmatica che possono agire come co-recettori in aggiunta a hACE210,11. In tutta la sequenza della proteina spike e in particolare all’interfaccia S1/S2, ci sono siti di scissione della proteasi che consentono la fusione sulla membrana dopo la serina proteasi 2 transmembrana (TMPRSS2)12. Varie proteine Spike RICOMBINANTI SARS-CoV-2 sono state prodotte da singoli domini di legame del recettore, a S1, S2, S1 con S2 e trimeri spike interi da più fornitori commerciali per l’uso in attività di ricerca13.
In questo lavoro, la superficie dei QD è stata funzionalizzata con trimeri spike ricombinanti che contengono un tag di istidina (QD-Spike). I QD prodotti dalla Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section contengono un nucleo di seleniuro di cadmio e un guscio di solfuro di zinco14,15. Lo zinco sulla superficie QD coordina i residui di istidina all’interno della proteina ricombinante per formare un QD funzionalizzato che assomiglia a una particella virale SARS-CoV-2 nella forma e nella funzione. La generazione delle nanoparticelle e della coniugazione proteica è stata precedentemente descritta utilizzando il dominio di legame del recettore coniugato QD15. Questo metodo descrive i preparati di coltura cellulare, il trattamento QD, l’acquisizione di immagini e il protocollo di analisi dei dati che possono guidare un ricercatore nello studio dell’attività di SARS-CoV-2 Spike nel contesto fisiologico di una cellula umana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto in questo articolo fornisce i passaggi necessari per l’imaging di QD funzionalizzati in cellule umane utilizzando la microscopia confocale ad alto rendimento. Questo metodo è più adatto per le cellule in cui l’endocitosi è la principale via di ingresso virale piuttosto che l’attività di TMPRSS2 e fusione di membrana, in quanto consente lo studio dell’endocitosi SARS-CoV-2 Spike e hACE2. A causa della natura del modello QD e del C-terminal His-tag sul trimero Spike disponibile in commercio, qualsia…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata in parte dal programma di ricerca intramurale del National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Il Naval Research Laboratory ha fornito finanziamenti attraverso il suo Nanoscience Institute interno. La preparazione dei reagenti è stata supportata tramite il fondo base NRL COVID-19.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
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