इन विट्रो में ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी के सभी जीवन चक्र चरणों के खिलाफ ड्रग स्क्रीनिंग β-गैलेक्टोसिडेस व्यक्त करने वाले परजीवी का उपयोग करके
Summary
हम चगास रोग के प्रेरक एजेंट ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी के तीन जीवन चक्र चरणों में β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि को मापने वाले एक उच्च-थ्रूपुट वर्णमितीय परख का वर्णन करते हैं। इस परख का उपयोग ट्रिपैनोसिडल यौगिकों को एक आसान, तेज़ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से पहचानने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी चागास रोग (सीएचडी) का प्रेरक एजेंट है, जो लैटिन अमेरिका में सार्वजनिक स्वास्थ्य महत्व की एक स्थानिक बीमारी है जो प्रवास में वृद्धि के कारण कई गैर-स्थानिक देशों को भी प्रभावित करती है। यह बीमारी लगभग 8 मिलियन लोगों को प्रभावित करती है, जिसमें प्रति वर्ष 50,000 नए मामलों का अनुमान है। 1 9 60 और 70 के दशक में, सीएचडी उपचार के लिए दो दवाएं पेश की गईं: निफर्टिमॉक्स और बेंज़निडाज़ोल (बीजेडएन)। दोनों नवजात शिशुओं में और बीमारी के तीव्र चरण के दौरान प्रभावी होते हैं लेकिन पुराने चरण में नहीं, और उनका उपयोग महत्वपूर्ण दुष्प्रभावों से जुड़ा होता है। ये तथ्य टी क्रूज़ी के खिलाफ नई दवाओं की खोज को तेज करने की तत्काल आवश्यकता को रेखांकित करते हैं।
क्रूजी रेडुविडे और हेमिप्टेरा परिवारों के हेमटोफैगस कीट वैक्टर के माध्यम से प्रेषित होता है। एक बार स्तनधारी मेजबान में, यह इंट्रासेल्युलर रूप से गैर-फ्लैगेलेटेड अमास्टिगोट रूप के रूप में गुणा करता है और ट्रिपोमास्टिगोट में अंतर करता है, रक्तप्रवाह गैर-प्रतिकृति संक्रामक रूप। कीट वेक्टर के अंदर, ट्रिपोमास्टिगोट्स एपिमास्टिगोट चरण में बदल जाते हैं और बाइनरी विखंडन के माध्यम से गुणा करते हैं।
यह पेपर सब्सट्रेट, क्लोरोफेनोल लाल β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड (सीपीआरजी) का उपयोग करके परजीवी लसीका के कारण संस्कृति में जारी साइटोप्लाज्मिक β-गैलेक्टोसिडेस की गतिविधि को मापने के आधार पर एक परख का वर्णन करता है। इसके लिए, टी क्रूज़ी डीएम 28 सी तनाव को β-गैलेक्टोसिडेस-ओवरएक्सप्रेसिंग प्लास्मिड के साथ ट्रांसफेक्ट किया गया था और एपिमास्टिगोट, ट्रिपोमास्टिगोट और अमास्टिगोट चरणों में इन विट्रो फार्माकोलॉजिकल स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता था। यह पत्र यह भी वर्णन करता है कि सुसंस्कृत एपिमास्टिगोट्स में एंजाइमेटिक गतिविधि को कैसे मापा जाए, अमास्टिगोट्स के साथ संक्रमित वेरो कोशिकाएं, और एक उदाहरण के रूप में संदर्भ दवा, बेंज़निडाज़ोल का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं से जारी ट्रिपोमास्टिगोट्स। यह वर्णमितीय परख आसानी से किया जाता है और इसे उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में स्केल किया जा सकता है और अन्य टी क्रूज़ी उपभेदों पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
चगास रोग (सीएचडी), या अमेरिकी ट्रिपैनोसोमियासिस, फ्लैगेलेटेड प्रोटोजोआ, ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी (टी क्रूज़ी) के कारण होने वाली एक परजीवी बीमारी है। सीएचडी एक स्पर्शोन्मुख या ऑलिगोसिम्प्टोमैटिक तीव्र चरण से शुरू होता है जो आमतौर पर अनियंत्रित होता है, इसके बाद आजीवन क्रोनिक चरण होता है। क्रोनिकता में, ~ 30% रोगी संक्रमण के दशकों बाद प्रकट होते हैं- मायोकार्डियोपैथी, मेगा-पाचन सिंड्रोम, या दोनों सहित विभिन्न प्रकार की दुर्बल स्थितियां, मृत्यु दर 0.2% से 20% 1,2,3 तक होती है। स्पर्शोन्मुख पुराने रोगियों में कोई नैदानिक संकेत नहीं हो सकते हैं लेकिन जीवन भर सीरोपॉजिटिव रहते हैं।
अनुमान बताते हैं कि दुनिया भर में ~ 7 मिलियन लोग संक्रमित हैं, ज्यादातर लैटिन अमेरिका से, जहां सीएचडी स्थानिक है। इन देशों में, टी क्रूज़ी मुख्य रूप से संक्रमित रक्त चूसने वाले ट्रायटोमाइन बग (वेक्टर-जनित संचरण) के माध्यम से प्रेषित होता है और परजीवी युक्त ट्रायटोमाइन मल से दूषित भोजन के अंतर्ग्रहण के माध्यम से मौखिक संचरण द्वारा कम बारप्रेषित होता है 2. इसके अतिरिक्त, परजीवी को नाल के माध्यम से चगासिक माताओं से नवजात शिशुओं में, रक्त आधान के माध्यम से, या अंग प्रत्यारोपण के दौरान प्रेषित किया जा सकता है। संक्रमण और मानव प्रवास प्राप्त करने के इन वेक्टर-स्वतंत्र तरीकों ने बीमारी के दुनिया भर में प्रसार में योगदान दिया है, जो उत्तरी अमेरिका, यूरोप और कुछ अफ्रीकी, पूर्वी भूमध्यसागरीय और पश्चिमी प्रशांत देशों में मामलों की बढ़ती संख्या से प्रमाणितहै। सीएचडी को एक उपेक्षित बीमारी माना जाता है क्योंकि वेक्टर-जनित संचरण गरीबी से निकटता से जुड़ा हुआ है और विशेष रूप से लैटिन अमेरिकी कम आय वाले देशों में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा है। यद्यपि उपलब्ध उपचार हैं, लैटिन अमेरिका में सीएचडी के कारण मृत्यु दर परजीवी रोगों में सबसे अधिक है, जिसमें मलेरिया2 भी शामिल है।
1960 के दशक के अंत और 1970 के दशक की शुरुआत में पेश किए गए सीएचडी उपचार के लिए दो पंजीकृत दवाएं हैं: निफर्टिमॉक्स और बेंज़निडाज़ोल5। दोनों दवाएं वयस्कों, बच्चों और जन्मजात रूप से संक्रमित नवजात शिशुओं के साथ-साथ पुराने संक्रमण वाले बच्चों में बीमारी के तीव्र चरण में प्रभावी हैं, जहां इलाज आमतौर पर प्राप्त किया जाता है। हालांकि, केवल कुछ ही लोगों को समय पर इलाज करने के लिए पर्याप्त जल्दी निदान किया जाता है। नवीनतम नैदानिक परीक्षणों के अनुसार, दोनों दवाओं की वयस्कों में महत्वपूर्ण सीमाएं हैं और पुरानी बीमारी वाले लोगों में लक्षणों को कम करने में अप्रभावी थीं; इसलिए, इस चरण में उनका उपयोग विवादास्पद है। अन्य कमियां लंबे समय तक आवश्यक उपचार अवधि (60-90 दिन) और लगातार, गंभीर प्रतिकूल प्रभाव देखी जाती हैं, जिससे संक्रमित लोगों के अनुपात में चिकित्सा बंद हो जाती है 6,7. यह अनुमान लगाया गया है कि सीएचडी वाले 10% से कम लोगों का निदान किया गया है, और यहां तक कि कम लोगों के पास उपचार तक पहुंच है, क्योंकि कई प्रभावित व्यक्ति ग्रामीण क्षेत्रों में रहते हैं, जिनके पास स्वास्थ्य सेवा तक कोई या दुर्लभ पहुंच नहींहै। ये तथ्य टी क्रूज़के खिलाफ नई दवाओं को खोजने की तत्काल आवश्यकता को उजागर करते हैं ताकि विशेष रूप से पुराने चरण के लिए अधिक कुशल, सुरक्षित और लागू-से-क्षेत्र उपचार की अनुमति मिल सके। इस संबंध में, अधिक प्रभावशाली यौगिकों के विकास में एक और चुनौती इन विट्रो और विवो9 में दवा प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए सिस्टम की सीमा है।
यद्यपि संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान के लिए रासायनिक जीव विज्ञान और जीनोमिक दृष्टिकोण का उपयोग कीनेटोप्लास्टिड परजीवी में किया गया है, टी क्रूज़ी में उपलब्ध जीनोमिक उपकरण टी। इस प्रकार, ट्रिपैनोसिडल गतिविधि के साथ यौगिकों की स्क्रीनिंग अभी भी सीएचडी के खिलाफ नए कीमोथेरेप्यूटिक दवा उम्मीदवारों की खोज में सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है आमतौर पर, टी क्रूज़ी में दवा की खोज एपिमास्टिगोट चरण के खिलाफ इन विट्रो परख में एक नई दवा के प्रभावों का परीक्षण करने के साथ शुरू होनी चाहिए। दशकों से, टी क्रूज़ी पर उम्मीदवार यौगिकों के निरोधात्मक प्रभावों को मापने का एकमात्र तरीका मैनुअल सूक्ष्म गिनती थी, जो श्रमसाध्य, समय लेने वाली और ऑपरेटर-निर्भर है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण यौगिकों की एक छोटी संख्या परख के लिए उपयुक्त है, लेकिन बड़े यौगिक पुस्तकालयों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अस्वीकार्य है। आजकल, कई जांच विभिन्न मूल से यौगिकों की एक विशाल संख्या के विश्लेषण के साथ शुरू होती है जो इन विट्रो में परख की जाती हैं, परजीवी वृद्धि को बाधित करने के लिए उनकी क्षमता का परीक्षण करती हैं। इन परखों में थ्रूपुट बढ़ाने, स्क्रीनिंग की निष्पक्षता में सुधार करने और पूरी प्रक्रिया को कम थकाऊ बनाने के लिए वर्णमितीय और फ्लोरोमेट्रिक दोनों विधियों को विकसित किया गया है।
सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली वर्णमिति विधियों में से एक ट्रांसफेक्टेड परजीवी की β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि पर आधारित है जिसे पहले बकनेट और सहयोगियों10 द्वारा वर्णित किया गया है। पुनः संयोजक परजीवियों द्वारा व्यक्त β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट, क्लोरोफेनोल रेड β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड (सीपीआरजी) को क्लोरोफेनोल लाल में हाइड्रोलाइज करता है, जिसे माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आसानी से मापा जा सकता है। इस प्रकार, विभिन्न यौगिकों की उपस्थिति में परजीवी वृद्धि का मूल्यांकन और माइक्रोटिटर प्लेटों में एक साथ मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस विधि को एपिमास्टिगोट रूपों (कीट वेक्टर में मौजूद), ट्रिपोमास्टिगोट्स और इंट्रासेल्युलर अमास्टिगोट्स, परजीवी के स्तनधारी चरणों में दवाओं का परीक्षण करने के लिए लागू किया गया है। इसके अलावा, एस्चेरिचिया कोलाई β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम को व्यक्त करने के लिए पीबीएस: सीएल-नियो -01 / बीसी-एक्स –10 प्लास्मिड (पीएलएसीजेड) 10 से संक्रमित कई पुनः संयोजक टी क्रूज़ी उपभेद पहले से ही उपलब्ध हैं (और नए लोगों का निर्माण किया जा सकता है), जो विभिन्न असतत टाइपिंग इकाइयों (डीटीयू) से परजीवी के मूल्यांकन की अनुमति देता है जोसमान रूप से व्यवहार नहीं कर सकते हैं . इस विधि का उपयोग पहले से ही कम और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग12,13 में टी क्रूज़ी के खिलाफ गतिविधि के लिए यौगिकों का मूल्यांकन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग अन्य प्रोटोजोआ परजीवी में भी किया गया है, जिसमें टोक्सोप्लाज्मा गोंडी और लीशमैनिया मैक्सिकना14,15 शामिल हैं।
यह पत्र β-गैलेक्टोसिडेस को व्यक्त करने वाले परजीवी का उपयोग करके टी क्रूज़ी के सभी जीवन चक्र चरणों के खिलाफ इन विट्रो ड्रग स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है और दिखाता है। यहां प्रस्तुत परखों को पीएलएसीजेड प्लास्मिड (डीएम 28 सी / पीएलएसीजेड) के साथ डीटीयू आई13 से टी क्रूज़ी डीएम 28 सी तनाव के अभिकर्मक द्वारा प्राप्त β-गैलेक्टोसिडेस-एक्सप्रेसिंग टी क्रूज़ी लाइन के साथ किया गया है। इसके अतिरिक्त, यौगिकों के बीच और टी क्रूज़ी उपभेदों या डीटीयू के बीच प्रदर्शन की तुलना करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर सब्सट्रेट सीपीआरजी की उपस्थिति में एमास्टिगोट्स के साथ टी क्रूज़ी एपिमास्टिगोट्स, ट्रिपोमास्टिगोट्स, या संक्रमित कोशिकाओं के झिल्ली लिसिस के कारण जारी साइटोप्लाज्मिक β-गैलेक्टोसिडेस ग?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृपया पीएलएसीजेड प्लास्मिड प्रदान करने के लिए डॉ बकनर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को अर्जेंटीना से अगेन्सिया नैशनल डी प्रोमोसियोन सिएंटिफिका वाई टेक्नोलोजिका, मिनिस्टरियो डी सिएन्सिया ई इनोवासियोन प्रोडक्टिवा (पीआईसीटी 2016-0439, पीआईसीटी 2019-0526, पीआईसीटी 2019-4212), और रिसर्च काउंसिल यूनाइटेड किंगडम [एमआर / सर्वियर मेडिकल आर्ट का उपयोग चित्रा 1 (https://smart.servier.com) का उत्पादन करने के लिए किया गया था।
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
- Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
- Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
- Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
- Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
- Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
- Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
- Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
- Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
- Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
- Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
- Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
- García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
- Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
- Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
- Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
- Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
- Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).
