インビトロ β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いた トリパノソーマクルジ のすべてのライフサイクル段階に対する薬物スクリーニング
Summary
シャーガス病の原因物質である トリパノソーマ・クルジの3つのライフサイクル段階におけるβ-ガラクトシダーゼ活性を測定するハイスループット比色アッセイについて述べる。このアッセイは、トリパノサイド化合物を容易、迅速、かつ再現性のある方法で同定するために使用することができる。
Abstract
トリパノソーマ・クルジ は、ラテンアメリカで公衆衛生上重要な風土病であるシャーガス病(ChD)の原因物質であり、移住の増加により多くの非流行国にも影響を及ぼします。この病気は800万人近くが罹患しており、新規症例は年間5万人と推定されています。1960年代と70年代には、ChD治療のための2つの薬物が導入されました:ニフルチモックスとベンズニダゾール(BZN)。どちらも新生児および疾患の急性期には有効であるが、慢性期には有効ではなく、それらの使用は重要な副作用と関連している。これらの事実は、 T. cruziに対する新薬の探索を強化する緊急の必要性を強調しています。
T. cruzi は、ReduviidaeおよびHemiptera科の血道昆虫ベクターを介して伝達される。哺乳類宿主に入ると、非鞭毛状アマスチゴート型として細胞内で増殖し、血流非複製性感染型であるトリポマスチゴテに分化する。昆虫ベクターの内部では、トリポマスチゴテスはエピマスティゴット段階に変化し、二元核分裂によって増殖する。
本論文では、基質であるクロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド(CPRG)を用いて寄生虫溶解により培養物中に放出される細胞質β-ガラクトシダーゼの活性を測定することに基づくアッセイについて述べる。このために、 T. cruzi Dm28c株にβ-ガラクトシダーゼ過剰発現プラスミドをトランスフェクトし、エピマスチゴテ、トリポマスチゴテ、およびアマスチゴーテの段階における インビトロ 薬理学的スクリーニングに使用した。また、参照薬ベンズニダゾールを用いて、培養エピマスチゴット、アマスチゴットに感染したVero細胞、培養細胞から放出されるトリポマスチゴットの酵素活性を測定する方法についても説明します。この比色アッセイは簡単に実施でき、ハイスループット形式にスケーリングし、他の T. cruzi 株に適用することができます。
Introduction
シャーガス病(ChD)、またはアメリカのトリパノソーマ症は、鞭毛原生動物、トリパノソーマクルジ(T. cruzi)によって引き起こされる寄生虫病です。ChDは、通常診断されていない無症候性または寡占症候性の急性期から始まり、生涯にわたる慢性期が続く。慢性化では、患者の〜30%が感染後数十年後、心筋症、巨消化症候群、またはその両方を含むさまざまな衰弱状態を示し、死亡率は0.2%から20%の範囲である1,2,3。無症候性の慢性患者は、臨床的徴候を有さないかもしれないが、生涯を通じて血清陽性のままである。
推定によると、世界中で約700万人が感染しており、そのほとんどはChDが風土病であるラテンアメリカから来ています。これらの国々では、 T. cruzi は主に感染した血液を吸うトリアトミンバグ(ベクター媒介性伝染)を介して伝染し、寄生虫を含むトリトミン糞便で汚染された食物の摂取による経口伝染によってはそれほど頻繁ではない2。さらに、寄生虫は、シャーガシックな母親から新生児への胎盤を介して、輸血を介して、または臓器移植中に伝達され得る。感染およびヒト移動を獲得するこれらのベクターに依存しない方法は、北米、ヨーロッパ、および一部のアフリカ、東地中海、および西太平洋諸国での症例数の増加によって証明され、この疾患の世界的な広がりに貢献しています4。ChDは、ベクター媒介性伝播が貧困と密接に関連しており、特にラテンアメリカの低所得国では主要な公衆衛生問題であるため、無視された疾患と考えられています。利用可能な治療法はありますが、ラテンアメリカのChDによる死亡率はマラリアを含む寄生虫病の中で最も高いです2。
1960年代後半から1970年代初頭に導入されたChD治療のための2つの登録薬があります:ニフルチモックスとベンズニダゾール5。両方の薬物は、成人、小児、および先天的に感染した新生児、ならびに治癒が通常達成される慢性感染を有する小児における疾患の急性期に有効である。しかし、時間内に治療を受けるのに十分な早期に診断されるのはごくわずかです。最新の臨床試験によると、両方の薬物は成人に重要な制限があり、慢性疾患患者の症状を軽減するのに効果がありません。したがって、この段階での使用は議論の余地があります。他の欠点は、必要な治療期間の延長(60〜90日)および観察される頻繁で重度の有害作用であり、感染者の割合で治療の中止につながる6,7。ChD患者の10%未満が診断を受けており、多くの罹患者が医療へのアクセスがない、またはほとんどない農村部に住んでいるため、治療を受けることができる人はさらに少ないと推定されています8。これらの事実は、特に慢性期において、より効率的で安全で、現場に適用可能な治療を可能にするために、T. cruziに対する新薬を見つける緊急の必要性を強調している。これに関して、より効果的な化合物の開発における別の課題は、インビトロおよびインビボでの薬物有効性を評価するためのシステムの限界である9。
潜在的な薬物標的の同定のためのケミカルバイオロジーおよびゲノムアプローチは、キネトプラスチド寄生虫において使用されてきたが、 T. cruzi において利用可能なゲノムツールは、 T. brucei または Leishmaniaとは対照的に限られている。したがって、トリパノサイド活性を有する化合物のスクリーニングは、ChDに対する新しい化学療法薬候補の探索において依然として最も使用されるアプローチであり、通常、 T. cruzi における創薬は、エピマスチゴート段階に対する in vitroアッセイにおける 新薬の効果を試験することから始めなければならない。何十年もの間、 T. cruzi に対する候補化合物の阻害効果を測定する唯一の方法は、手作業による顕微鏡計数であり、これは手間がかかり、時間がかかり、オペレータに依存していました。さらに、このアプローチは、少数の化合物をアッセイするのには適しているが、大規模な化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングには受け入れられない。今日、多くの研究は、 インビトロでアッセイされる異なる起源からの膨大な数の化合物の分析から始まり、寄生虫の成長を阻害する能力をテストする。比色法と蛍光法の両方が開発され、これらのアッセイのスループットを向上させ、スクリーニングの客観性を向上させ、プロセス全体の退屈さを軽減します9。
最も広く使用されている比色法の1つは、Bucknetおよび共同研究者10によって最初に記載されたトランスフェクト寄生虫のβ−ガラクトシダーゼ活性に基づくものである。組換え寄生虫によって発現されるβ-ガラクトシダーゼ酵素は、発色基質、クロロフェノールレッドβ-D-ガラクトピラノシド(CPRG)、クロロフェノールレッドを加水分解し、マイクロプレート分光光度計を用いて比色法で容易に測定することができる。したがって、種々の化合物の存在下での寄生虫増殖は、マイクロタイタープレートにおいて同時に評価および定量することができる。この方法は、寄生虫の哺乳類の段階であるエピマスチゴート形態(昆虫ベクター中に存在する)、トリポマスチゴット、および細胞内アマスチゴテスの試験薬物に適用されている。さらに、大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素を発現するためにpBS:CL-Neo-01/BC-X-10プラスミド(pLacZ)10を導入したいくつかの組換えT. cruzi株がすでに入手可能であり(そして新しいものを構築することができる)、同じ化合物に対して等しく振る舞わない可能性のある異なる離散型型単位(DTU)からの寄生虫の評価を可能にする10、11、12、13.この方法は、低スループットおよびハイスループットスクリーニングにおけるT. cruziに対する活性について化合物を評価するために既に首尾よく使用されている12、13。同様のアプローチは、トキソプラズマ・ゴンディイおよびリーシュマニア・メキシカーナを含む他の原生動物寄生虫においても使用されている14,15。
この論文は、β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いて、T. cruziのすべてのライフサイクル段階に対するin vitro薬物スクリーニングのための詳細な方法を記載し、示している。ここで提示するアッセイは、DTU I13由来のT. cruzi Dm28c株をpLacZプラスミド(Dm28c/pLacZ)でトランスフェクションすることによって得られたβ-ガラクトシダーゼ発現T. cruzi株を用いて実施された。さらに、同じプロトコルを他の株に容易に適合させて、化合物間およびT. cruzi株またはDTU間の性能を比較することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文は、基質CPRGの存在下で、T. cruzi epimastigotes、trypomastigotes、またはアマスチゴテスに感染した細胞の膜溶解のために放出される細胞質β-ガラクトシダーゼ活性を決定することに基づくアッセイについて記載する。我々は、Bucknerと共著者ら10によって構築されたβ-ガラクトシダーゼ担持プラスミドとのトランスフェクション後に得られた安定な寄生虫株であるT…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pLacZプラスミドを提供してくれたバックナー博士に感謝します。この研究は、アルゼンチンのAgencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica、Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212)、Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]の支援を受けた。Servier Medical Artは 、図1 (https://smart.servier.com)の制作に使用されました。
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
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