तीन-फोटॉन माइक्रोस्कोपी उच्च-विपरीत प्रतिदीप्ति इमेजिंग को जीवित जैविक ऊतकों में गहराई से सक्षम बनाता है, जैसे कि माउस और ज़ेब्राफ़िश दिमाग, उच्च स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन के साथ।
मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, जैसे कि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी (2 PM) और तीन-फोटॉन माइक्रोस्कोपी (3PM), उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन के साथ विवो इमेजिंग में गहरे ऊतक के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। 3PM में 2PM पर गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए दो प्रमुख फायदे हैं जो जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं: (i) ~ 1,300 एनएम या ~ 1,700 एनएम उत्तेजना लेजर को नियोजित करके बिखरने वाले ऊतकों में लंबी क्षीणन लंबाई; (ii) उच्च-क्रम अरेखीय उत्तेजना के कारण कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति उत्पादन। नतीजतन, 3PM उच्च-विपरीत संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग को प्रकीर्णन ऊतकों के भीतर गहराई से अनुमति देता है जैसे कि कॉर्टिकल परतों से हिप्पोकैम्पस तक बरकरार माउस मस्तिष्क और वयस्क ज़ेब्राफ़िश के पूरे अग्रमस्तिष्क।
आज, 3PM के लिए उपयुक्त लेजर स्रोत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जो मौजूदा दो-फोटॉन (2P) इमेजिंग सिस्टम को तीन-फोटॉन (3P) सिस्टम में परिवर्तित करने में सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, कई वाणिज्यिक 3 पी माइक्रोस्कोप उपलब्ध हैं, जो इस तकनीक को जीव विज्ञान अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध कराता है। यह पेपर एक विशिष्ट 3PM सेटअप के अनुकूलन को दिखाता है, विशेष रूप से जीव विज्ञान समूहों को लक्षित करता है जिनके पास पहले से ही 2P सेटअप है, और बरकरार माउस और वयस्क ज़ेब्राफ़िश दिमाग में इंट्रावाइटल 3 डी इमेजिंग प्रदर्शित करता है। इस प्रोटोकॉल में माइक्रोस्कोप संरेखण, ~ 1,300 और ~ 1,700 एनएम लेजर दालों, पशु तैयारी, और इंट्रावाइटल 3 पी प्रतिदीप्ति इमेजिंग वयस्क ज़ेब्राफ़िश और माउस दिमाग में गहरी इंट्रावाइटल 3 पी प्रतिदीप्ति इमेजिंग सहित 3 पी इमेजिंग की पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया शामिल है।
जीवन विज्ञान में, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी (एमपीएम) तकनीक, जैसे कि 2PM और 3PM, उच्च स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन और बिखरने वाले ऊतकों में उच्च विपरीत के साथ विवो इमेजिंग में गहरे के लिए शक्तिशाली उपकरण रहे हैं। इसके अतिरिक्त, ये विधियां एक-फोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 1,2,3,4 की तुलना में कम फोटोब्लीचिंग का कारण बनती हैं। दो प्रमुख विशेषताओं के कारण 2PM की तुलना में 3PM गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए फायदेमंद है: (i) लंबी तरंग दैर्ध्य उत्तेजना (~ 1,300 एनएम या ~ 1,700 एनएम) का रोजगार ऊतक प्रकीर्णन को कम करता है, और (ii) उच्च-क्रम उत्तेजना प्रक्रिया (यानी, प्रतिदीप्ति संकेत 2PM में उत्तेजना शक्ति के वर्ग के बजाय 3PM में उत्तेजना शक्ति के घन पर निर्भर करता है) जो अवांछित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति3 को दबादेता है . नतीजतन, 3PM जीवित ऊतकों में गहरे क्षेत्रों में उच्च-विपरीत इमेजिंग को सक्षम बनाता है जैसे कि एक बरकरार वयस्क माउस मस्तिष्क में हिप्पोकैम्पस 3,5,6,7,8,9,10,11 और वयस्क ज़ेब्राफ़िश12 के पूरे अग्रमस्तिष्क, जिसमें Ca2 + भी शामिल है। गतिविधि रिकॉर्डिंग और बहुरंगी टिप्पणियों. इसके अलावा, माउस और वयस्क ज़ेब्राफ़िश12,13 की बरकरार खोपड़ी के माध्यम से 3PM के साथ उच्च-विपरीत छवियों को प्राप्त किया गया है।
आज, ~ 1,300 और ~ 1,700 एनएम पर 3P उत्तेजना (3PE) के लिए उपयुक्त उत्तेजना लेजर स्रोत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। चूंकि लेजर स्कैनिंग सिस्टम अनिवार्य रूप से 2PM और 3PM के लिए समान है, इसलिए मौजूदा 2P सेटअप को 3P सेटअप में परिवर्तित करना जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में 3PE के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर की स्थापना के साथ संभव है। 3P प्रतिदीप्ति संकेत लेजर शक्ति, नाड़ी अवधि, लेजर पुनरावृत्ति दर, और उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) पर निर्भर करता है। एक विवर्तन-सीमित फोकस मानते हुए (यानी, उद्देश्य लेंस का बैक एपर्चर उत्तेजना बीम द्वारा ओवरफिल किया जाता है), Eq (1) 3PE के परिणामस्वरूप फोकल वॉल्यूम से समय-औसत प्रतिदीप्ति फोटॉन फ्लक्स का वर्णन करता है।
(1)
जहां f लेजर पुनरावृत्ति दर है, π लेजर पल्स अवधि (आधे अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई) है, φ सिस्टम संग्रह दक्षता है, η प्रतिदीप्ति क्वांटम दक्षता है, σ3P अवशोषण क्रॉस-सेक्शन है, C फ्लोरोफोर एकाग्रता है, n0 नमूना माध्यम का प्रतिबिंबित सूचकांक है (उदाहरण के लिए, पानी), π निर्वात में उत्तेजना तरंग दैर्ध्य है, एनए उद्देश्य लेंस का संख्यात्मक एपर्चर है, ए3 फोकल वॉल्यूम का स्थानिक एकीकरण स्थिरांक है, उद्देश्य लेंस के नीचे समय-औसत उत्तेजना फोटॉन फ्लक्स (फोटॉन / एस) है, जेड छविदार गहराई है, और ईएएल प्रभावी क्षीणन लंबाई14 है। यहां हमने मान लिया है कि ईएएल (आमतौर पर > 100 μm) माइक्रोस्कोप के अक्षीय रिज़ॉल्यूशन (आमतौर पर 10 μm <) की तुलना में बहुत अधिक है। पराक्षीय सन्निकटन के तहत, एक3 28.114 के बराबर है। gp(3) उत्तेजना स्रोत का 3rd-order temporal coherence है, और gp(3) क्रमशः हाइपरबोलिक-secant-squared दालों और गाऊसी दालों के लिए 0.41 और 0.51 है। φ संग्रह दक्षता उद्देश्य लेंस द्वारा प्रतिदीप्ति संग्रह पर विचार करके अनुमान लगाया जा सकता है, उद्देश्य लेंस के संचरण, dichroic दर्पण की परावर्तकता, फिल्टर के संचरण, और डिटेक्टर का पता लगाने की दक्षता (जैसे, photomultiplier ट्यूब, या PMT)। चूंकि 3P प्रतिदीप्ति तीव्रता विभिन्न मापदंडों पर अत्यधिक निर्भर है, इसलिए 3P प्रतिदीप्ति संकेतों को अधिकतम करने के लिए 3P सेटअप का अनुकूलन आवश्यक है।
यह प्रोटोकॉल एक विशिष्ट 3 पी सेटअप की अनुकूलन प्रक्रिया को दर्शाता है, जो विशेष रूप से जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी होगा, जिनके पास 2 पी सेटअप है और 3 पी इमेजिंग के लिए अपनी क्षमता का विस्तार करने या इष्टतम प्रदर्शन पर अपने वाणिज्यिक 3 पी सेटअप को बनाए रखने की योजना है। यह वीडियो लेख जीवित जानवरों के दिमाग में गहरे ऊतक 3 पी इमेजिंग को भी दर्शाता है। पहला खंड व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्रोत और मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ एक विशिष्ट 3 पी सेटअप के अनुकूलन को संबोधित करता है। दूसरे और तीसरे खंड ों में क्रमशः न्यूरोनल संरचनाओं और गतिविधियों के 3PM के लिए ज़ेबराफ़िश और माउस तैयारी का वर्णन किया गया है। माउस क्रैनियोटॉमी सर्जरी को पहले प्रोटोकॉल पेपरों में भी15,16,17 की सूचना दी गई थी। चौथा खंड ज़ेबराफ़िश और माउस दिमाग में इंट्रावाइटल 3 पी इमेजिंग को दर्शाता है।
यह प्रोटोकॉल एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप और लेजर स्रोत के साथ 3 पी इमेजिंग स्थापित करने के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं की व्याख्या करता है। 2PM की तुलना में, माउस मस्तिष्क हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे क्षेत्रों में ऑप्टिकल एक्सेस की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों में 3PM का लाभ है। हालांकि 3PM ज्यादातर तंत्रिका विज्ञान में उपयोग किया जाता है, 3PM को संभावित रूप से अन्य ऊतकों जैसे लिम्फ नोड्स, हड्डियों और ट्यूमर में गहरे ऊतक अवलोकन के लिए लागू किया जा सकता है।
यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि इमेजिंग सिस्टम शॉट-शोर सीमा के करीब प्रदर्शन करता है, जो यह सुनिश्चित करता है कि पता लगाने और डेटा अधिग्रहण इलेक्ट्रॉनिक्स पीएमटी के बाद छवि में नगण्य शोर का योगदान करते हैं। पता लगाए गए फोटॉनों की संख्या में अनिश्चितता फोटॉन शॉट शोर द्वारा मौलिक रूप से सीमित है। शॉट-शोर सीमित प्रदर्शन को एक उच्च-लाभ फोटोडिटेक्टर (जैसे, एक पीएमटी) का उपयोग करके एक विशिष्ट मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप में प्राप्त किया जा सकता है। फोटॉन शॉट शोर एक पॉइसन सांख्यिकीय वितरण का अनुसरण करता है, जिसमें वितरण का मानक विचलन वितरण के माध्य के वर्ग मूल के बराबर होता है। शॉट-शोर सीमित प्रदर्शन सत्यापित करने के लिए, प्रोटोकॉल अनुभाग में चरण 1.14 का पालन करें।
एच2ओ द्वारा प्रकाश क्षीणन से बचने के लिए, विसर्जन के लिए डी2ओ का उपयोग करना सहायक है, विशेष रूप से ~ 1,700 एनएम उत्तेजना के लिए। जब D2O का उपयोग किया जाता है, तो हर ~ 10 मिनट में D2O को ताज़ा करना या इमेजिंग के दौरान D 2 O/ H2O विनिमय से बचने के लिए D2O की एक बड़ी मात्रा का उपयोग करना आवश्यक है। कोई भी कमरे के वातावरण 3 से डी2ओ को सील कर सकताहै। यदि इमेजिंग के लिए एक लंबी कार्य दूरी (डब्ल्यूडी) उद्देश्य लेंस (उदाहरण के लिए, 4 मिमी या उससे अधिक समय पर डब्ल्यूडी) का उपयोग किया जाता है, तो विसर्जन तरल मोटाई 2-3 मिमी से अधिक हो सकती है। बढ़ी हुई मोटाई एच2ओ अवशोषण को गैर-नगण्य बनाती है, यहां तक कि ~ 1,300 एनएम21 पर भी। इसलिए, एक लंबे WD उद्देश्य लेंस का उपयोग करते समय D2O 1,300 nm 3PM के लिए भी आवश्यक हो सकता है।
चूंकि 3 पी प्रतिदीप्ति तीव्रता फोकस (Eq. (1)) पर उत्तेजना नाड़ी ऊर्जा के घन पर निर्भर करती है, इसलिए उचित लेजर शक्ति की स्थापना विशेष रूप से जीवित ऊतकों में थर्मल और नॉनलाइनर क्षति से बचने के दौरान पर्याप्त 3 पी प्रतिदीप्ति संकेतों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। औसत लेजर शक्ति को थर्मल क्षति सीमा से नीचे रखा जाना चाहिए। माउस मस्तिष्क में, उदाहरण के लिए, थर्मल ऊतक क्षति से बचने के लिए, माउस मस्तिष्क की सतह पर औसत शक्ति को 1 मिमी की गहराई पर ~ 1,300 एनएम उत्तेजना के लिए ~ 100 mW पर या उससे नीचे रखा जाना चाहिए और 230 μm x 230μm 21 के फील्ड-ऑफ-व्यू (FOV) के साथ। इसी तरह, ~ 1,700 एनएम पर औसत शक्ति को ~ 1 मिमी की गहराई पर ~ 50 mW पर या उससे नीचे रखा जाना चाहिए और ~ 230 μm x 230 μm (अप्रकाशित डेटा) का एक एफओवी। इसके अलावा, उत्तेजना संतृप्ति और संभावित nonlinear क्षति से बचने के लिए, उत्तेजना नाड़ी ऊर्जा को क्रमशः 30 के लिए ~ 1,300 एनएम और ~ 1,700 एनएम उत्तेजना के लिए 2 एनजे और3 एनजे पर रखा जाना चाहिए।
ऊतकों में प्रकाश अवशोषण और प्रकीर्णन के कारण, फोकस में नाड़ी ऊर्जा 1 ईएएल द्वारा ऊतकों के प्रवेश के बाद 1/e (~ 37%) तक क्षीण हो जाती है। ईएएल विभिन्न ऊतकों में और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ भिन्न होता है, उदाहरण के लिए, माउस मस्तिष्क के नियोकॉर्टेक्स में, ईएएल ~ 300 μm और ~ 400 μm ~ 1,300 एनएम और ~ 1,700 एनएम पर क्रमशः 3,29 (चित्रा 5) है। इसलिए, एक ही नाड़ी ऊर्जा को ध्यान में रखने के लिए (जैसे, 1 एनजे / पल्स) एन ईएएल की गहराई पर, सतह नाड़ी ऊर्जा को 1 एनजे × ईएन से गुणा करने की आवश्यकता होती है। संरचनात्मक और कार्यात्मक गतिशीलता की तेजी से इमेजिंग के लिए, एक उच्च पुनरावृत्ति दर (1 मेगाहर्ट्ज या उच्चतर पर) के साथ एक उत्तेजना लेजर एक उच्च फ्रेम दर 5,6,7,10 प्राप्त करने के लिए वांछनीय है। हालांकि, नाड़ी ऊर्जा की आवश्यकता और औसत लेजर शक्ति सीमा लागू पुनरावृत्ति दर को बाधित करती है।
उदाहरण के लिए, जब हम 4 ईएएल पर एक मामूली गहरे क्षेत्र की छवि बनाते हैं (यानी, 1,300 एनएम उत्तेजना के साथ माउस कॉर्टेक्स में ~ 1.2 मिमी), सतह पर ~ 55 एनजे / पल्स को ध्यान में रखने के लिए 1 एनजे / पल्स रखने की आवश्यकता होती है। जब औसत शक्ति सीमा 100 mW है, तो हम एक ~ 2 मेगाहर्ट्ज लेजर पुनरावृत्ति दर लागू कर सकते हैं। हालांकि, 7 ईएएल की गहराई पर गहरी छवि बनाने के लिए, फोकस पर 1 एनजे / पल्स बनाए रखने के लिए सतह पर ~ 1,100 एनजे / पल्स की आवश्यकता होती है। थर्मल क्षति से बचने के लिए अधिकतम औसत शक्ति 100 mW है, यह मानते हुए कि सतह पर 1,100 nJ / पल्स प्राप्त करने के लिए लेजर पुनरावृत्ति दर को 0.1 मेगाहर्ट्ज तक कम किया जाना चाहिए। तालिका 1 माउस मस्तिष्क प्रांतस्था में विशिष्ट इमेजिंग स्थितियों को सारांशित करती है। ध्यान दें कि तालिका 1 में इमेजिंग गहराई मान लें कि EAL पूरे माउस कॉर्टेक्स में समान है।
इसके अलावा, गहरे ऊतक 3PM में लेजर पावर सीमा के कारण, फ्रेम दर और छवि पिक्सेल आकार के बीच एक ट्रेड-ऑफ मौजूद है, जो कैल्शियम इमेजिंग जैसे कार्यात्मक इमेजिंग के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अधिकतम उपलब्ध लेजर पुनरावृत्ति दर फोकस में आवश्यक नाड़ी ऊर्जा और लागू औसत लेजर शक्ति के आधार पर प्रत्येक गहराई पर तय की जाती है जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, उदाहरण के लिए, 1,300 एनएम उत्तेजना के साथ ~ 4 ईएएल के बराबर गहराई पर 2 मेगाहर्ट्ज। सामान्य तौर पर, इमेजिंग के लिए प्रति पिक्सेल कम से कम एक पल्स की आवश्यकता होती है। तदनुसार, न्यूनतम उपलब्ध पिक्सेल रहने का समय लेजर पुनरावृत्ति दर द्वारा निर्धारित किया जाता है, उदाहरण के लिए, 2 मेगाहर्ट्ज उत्तेजना के साथ 0.5 μs / पिक्सेल।
3P छवियों में उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन (पार्श्व में ~ 1 μm) रखने के लिए, यह ~ 1 μm2 के क्षेत्र में 1 पिक्सेल सेट करने के लिए आदर्श है, उदाहरण के लिए, 250 x 250 μm2 के FOV के लिए 256 x 256 पिक्सेल। इसलिए, काफी बड़े FOV (उदाहरण के लिए, 256 x 256 पिक्सेलके साथ 250 x 250 μm 2), 0.5 मेगाहर्ट्ज, 1 मेगाहर्ट्ज, और 2 मेगाहर्ट्ज पल्स पुनरावृत्ति दर क्रमशः ~ 7.6, ~ 15, और ~ 30 फ्रेम / एस की सैद्धांतिक अधिकतम फ्रेम दरों को सैद्धांतिक अधिकतम फ्रेम दर देते हैं। इसी तरह, लेजर पुनरावृत्ति दर का अनुकूलन आवश्यक है, लक्ष्य की गहराई, स्कैन गति और एफओवी के आधार पर, थर्मल क्षति सीमा के तहत पर्याप्त पल्स ऊर्जा लागू करने के लिए। इमेजिंग गति को बढ़ाने के लिए, एक अनुकूली उत्तेजना स्रोत का उपयोग न्यूरॉन्स (यानी, ब्याज के क्षेत्रों) पर सभी उत्तेजना दालों को केंद्रित करने के लिए किया जा सकता है, जो न्यूरॉन्स31 की मांग पर लेजर दालों को वितरित करता है।
3PM लाभप्रद है जब जीवित ऊतकों के भीतर गहरी इमेजिंग में 2PM की तुलना में और अत्यधिक बिखरने वाले मीडिया जैसे खोपड़ी, हड्डियों और माउस मस्तिष्क के सफेद पदार्थ परत (यानी, बाहरी कैप्सूल) के माध्यम से। लंबे समय तक EAL और 3PE के उच्च-क्रम nonlinear उत्तेजना गहरे ऊतक इमेजिंग लाभ. उदाहरण के लिए, माउस कॉर्टेक्स में GCaMP6 की छवि बनाने के लिए, 920 एनएम उत्तेजना के साथ 2P प्रतिदीप्ति संकेत 690 μm पर उथले क्षेत्रों में 1,300 एनएम उत्तेजना के साथ 3P प्रतिदीप्ति संकेत से अधिक है (यानी, 1,300 एनएम पर ~ 2.3 ईएएल) 21। हालांकि, 920 एनएम की तुलना में 1,300 एनएम पर लंबे समय तक ईएएल के कारण, 3पीई ~ 690 μm और गहरे 21 की गहराई पर 2P उत्तेजना (2PE) की तुलना में मजबूत प्रतिदीप्ति देता है। इस गहराई को ‘सिग्नल क्रॉसओवर गहराई’ के रूप में परिभाषित किया गया है, जिस पर 2PE और 3PE की प्रतिदीप्ति सिग्नल ताकत एक ही पुनरावृत्ति दर और समान अधिकतम स्वीकार्य औसत शक्तियों21 के समान है। सिग्नल क्रॉसओवर गहराई 2PE और 3PE और फ्लोरोफोर के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर निर्भर करती है।
व्यवहार में, 920 एनएम उत्तेजना कम पानी के अवशोषण के कारण 1,300 एनएम उत्तेजना की तुलना में उच्च औसत लेजर शक्ति की अनुमति देती है। हालांकि, 2PE की उच्च औसत शक्ति सिग्नल क्रॉसओवर गहराई को केवल 0.9 EALs4 द्वारा धक्का देगी। इसके अलावा, जब नमूना घनी लेबल किया जाता है, तो 3PE में बहुत अधिक SBR का अतिरिक्त लाभ होता है। इसलिए, सिग्नल क्रॉसओवर लंबाई तक पहुंचने से पहले भी, 3PM 2PM की तुलना में इमेजिंग के लिए बेहतर हो सकता है। उदाहरण के लिए, जब माउस मस्तिष्क वास्कुलचर इमेजिंग, जिसमें ~ 2% का वॉल्यूम अंश (यानी, लेबलिंग घनत्व) होता है, 100 mW उत्तेजना शक्ति के साथ 1,300 nm 3PM फ्लोरोसीन के लिए ~ 700 μm की गहराई पर 200 mW उत्तेजना शक्ति के साथ 920 nm 2PM को मात देता है।
3PM में एक पतली लेकिन अत्यधिक बिखरने वाली परत के माध्यम से इमेजिंग करते समय भी एक लाभ होता है जो उत्तेजना बीम के बिंदु-प्रसार समारोह को विकृत कर सकता है और एक डिफोकस पृष्ठभूमि 4 उत्पन्न कर सकताहै। उदाहरण के लिए, माउस मस्तिष्क की बरकरार खोपड़ी के माध्यम से, 2PM छवियां मस्तिष्क की सतह13 से <100 μm की उथली गहराई पर भी defocus पृष्ठभूमि से पीड़ित हैं। एक समान defocus पृष्ठभूमि माउस मस्तिष्क 32 में सफेद पदार्थ के माध्यम से 1,280 एनएम उत्तेजना के साथ2PM में मनाया गया था। इसलिए, जब ऊतकों को टर्बिड परतों के माध्यम से चित्रित किया जाता है, तो लेबलिंग घनत्व की परवाह किए बिना उच्च-विपरीत इमेजिंग के लिए 3PM 2PM से बेहतर होता है।
हमने हाल ही में एक मोतियों के प्रेत और सैद्धांतिक विश्लेषण की सूचना दी है जो दिखाता है कि 3PM की इमेजिंग गहराई सीमा 8 EALs33 से अधिक है; 8 ईएएल माउस कॉर्टेक्स में ~ 1,700 एनएम उत्तेजना के साथ ~ 3 मिमी के बराबर हैं। हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध लेजर में माउस मस्तिष्क में 8 ईएएल प्राप्त करने के लिए पर्याप्त नाड़ी ऊर्जा नहीं है। मजबूत लेजर के आगे के विकास 3PM की वर्तमान इमेजिंग गहराई सीमा धक्का होगा.
The authors have nothing to disclose.
इस काम को NSF DBI-1707312 कॉर्नेल NeuroNex हब और NIH 1U01NS103516 द्वारा समर्थित किया गया था।
5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |