Die Drei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht eine kontrastreiche Fluoreszenzbildgebung tief in lebenden biologischen Geweben wie Maus- und Zebrafischgehirnen mit hoher raumzeitlicher Auflösung.
Multiphotonenmikroskopie-Techniken wie die Zwei-Photonen-Mikroskopie (2PM) und die Drei-Photonen-Mikroskopie (3PM) sind leistungsstarke Werkzeuge für die Tiefengewebe-In-vivo-Bildgebung mit subzellulärer Auflösung. 3PM hat zwei Hauptvorteile für die Tiefengewebebildgebung gegenüber 2PM, die in Biologielabors weit verbreitet ist: (i) längere Dämpfungslänge in streuendem Gewebe durch den Einsatz von ~ 1.300 nm oder ~ 1.700 nm Anregungslaser; (ii) geringere Hintergrundfluoreszenzerzeugung aufgrund einer nichtlinearen Anregung höherer Ordnung. Infolgedessen ermöglicht 3PM eine kontrastreiche strukturelle und funktionelle Bildgebung tief in streuendem Gewebe wie dem intakten Mausgehirn von den kortikalen Schichten bis zum Hippocampus und dem gesamten Vorderhirn erwachsener Zebrafische.
Heute sind Laserquellen, die für 3PM geeignet sind, kommerziell erhältlich, was die Umwandlung eines bestehenden Zwei-Photonen-Bildgebungssystems (2P) in ein Drei-Photonen-System (3P) ermöglicht. Darüber hinaus sind mehrere kommerzielle 3P-Mikroskope erhältlich, wodurch diese Technik für biologische Forschungslaboratorien leicht zugänglich ist. Dieses Papier zeigt die Optimierung eines typischen 3PM-Setups, insbesondere für Biologiegruppen, die bereits ein 2P-Setup haben, und demonstriert intravitale 3D-Bildgebung in intakten Maus- und erwachsenen Zebrafischgehirnen. Dieses Protokoll deckt das gesamte experimentelle Verfahren der 3P-Bildgebung ab, einschließlich Mikroskopausrichtung, Vorzwitschern von ~ 1.300 und ~ 1.700 nm Laserpulsen, Tierpräparation und intravitaler 3P-Fluoreszenzbildgebung tief in erwachsenen Zebrafisch- und Mäusegehirnen.
In den Biowissenschaften waren Multiphotonenmikroskopie-Techniken (MPM) wie 2PM und 3PM leistungsstarke Werkzeuge für die tiefe In-vivo-Bildgebung mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung und hohem Kontrast in streuenden Geweben. Darüber hinaus verursachen diese Methoden weniger Photobleichen im Vergleich zur konfokalen Ein-Photonen-Mikroskopie 1,2,3,4. 3PM ist vorteilhaft für tiefere Gewebebildgebung im Vergleich zu 2PM aufgrund von zwei Hauptmerkmalen: (i) Die Verwendung einer längerwelligen Anregung (~ 1.300 nm oder ~ 1.700 nm) reduziert die Gewebestreuung und (ii) der Anregungsprozess höherer Ordnung (dh das Fluoreszenzsignal hängt vom Würfel der Anregungsleistung in 3PM anstelle des Quadrats der Anregungsleistung in 2PM ab), der die unerwünschte Hintergrundfluoreszenz unterdrückt3 . Folglich ermöglicht 3PM eine kontrastreiche Bildgebung an tieferen Regionen in lebenden Geweben wie dem Hippocampus in einem intakten erwachsenen Mausgehirn 3,5,6,7,8,9,10,11 und dem gesamten Vorderhirn des erwachsenen Zebrafisches 12, einschließlich Ca2+. Aktivitätsaufzeichnung und mehrfarbige Beobachtungen. Darüber hinaus wurden mit 3PM durch die intakten Schädel von Maus und adulten Zebrafischen12,13 kontrastreiche Bilder erhalten.
Heute sind Anregungslaserquellen, die für die 3P-Anregung (3PE) bei ~1.300 und ~1.700 nm geeignet sind, im Handel erhältlich. Da das Laserscanning-System für 2PM und 3PM im Wesentlichen gleich ist, ist die Umstellung eines bestehenden 2P-Setups in ein 3P-Setup in Biologielabors mit der Installation eines kommerziell erhältlichen Lasers für 3PE möglich. Das 3P-Fluoreszenzsignal hängt von der Laserleistung, der Pulsdauer, der Laserwiederholrate und der numerischen Apertur (NA) der Objektivlinse ab. Unter der Annahme eines beugungsbegrenzten Fokus (d. h. die Rückblende der Objektivlinse wird durch den Anregungsstrahl überfüllt), beschreibt Eq (1) den zeitgemittelten Fluoreszenzphotonenfluss aus dem von 3PE resultierenden Brennvolumen.
(1)
Dabei ist f die Laserwiederholrate, τ die Laserpulsdauer (volle Breite bei halbem Maximum), φ ist die Systemsammlungseffizienz, η ist die Fluoreszenzquanteneffizienz, σ 3 ist der 3P-Absorptionsquerschnitt, C ist die Fluorophorkonzentration, n0 ist der Reflexionsindex des Probenmediums (z. B. Wasser), λ ist die Anregungswellenlänge im Vakuum, NA ist die numerische Apertur der Objektivlinse, a 3 ist die räumliche Integrationskonstante des Brennvolumens, ist der zeitgemittelte Anregungsphotonenfluss (Photonen/s) unter der Objektivlinse, z ist die abgebildete Tiefe und EAL ist die effektive Dämpfungslänge14. Hier haben wir angenommen, dass der EAL (typischerweise > 100 μm) viel größer ist als die axiale Auflösung des Mikroskops (typischerweise < 10 μm). Unter paraxialer Näherung ist eine3 gleich 28,114. GP(3) ist die zeitliche Kohärenz der Anregungsquelle 3. Ordnung, und gp(3) ist 0,41 bzw. 0,51 für hyperbolisch-sekant-quadratische Impulse bzw. Gaußsche Impulse. Die Abscheideeffizienz φ kann unter Berücksichtigung der Fluoreszenzsammlung durch die Objektivlinse, der Transmission der Objektivlinse, der Reflektivität des dichroitischen Spiegels, der Durchlässigkeit der Filter und der Detektionseffizienz des Detektors (z. B. Photomultiplierröhre oder PMT) geschätzt werden. Da die 3P-Fluoreszenzintensität stark von verschiedenen Parametern abhängt, ist eine Optimierung des 3P-Aufbaus erforderlich, um die 3P-Fluoreszenzsignale zu maximieren.
Dieses Protokoll veranschaulicht den Optimierungsprozess eines typischen 3P-Setups, der insbesondere für Biologielabors nützlich sein wird, die über ein 2P-Setup verfügen und planen, seine Fähigkeit auf 3P-Bildgebung auszuweiten oder ihr kommerzielles 3P-Setup mit optimaler Leistung zu halten. Dieser Videoartikel demonstriert auch die 3P-Bildgebung von Tiefengewebe in lebenden Tiergehirnen. Der erste Abschnitt befasst sich mit der Optimierung eines typischen 3P-Aufbaus mit einer handelsüblichen Laserquelle und einem Multiphotonenmikroskop. Der zweite und dritte Abschnitt beschreiben die Vorbereitung von Zebrafischen bzw. Mäusen auf 15 Uhr neuronaler Strukturen und Aktivitäten. Die Kraniotomie-Operation der Maus wurde bereits in Protokollpapieren sowiede 15,16,17 berichtet. Der vierte Abschnitt demonstriert die intravitale 3P-Bildgebung in Zebrafisch- und Mäusegehirnen.
Dieses Protokoll erklärt Schritt-für-Schritt-Verfahren zum Einrichten der 3P-Bildgebung mit einem kommerziellen Mikroskop und einer Laserquelle. Im Vergleich zu 2PM hat 3PM einen Vorteil bei Anwendungen, die einen optischen Zugang in den tieferen Regionen erfordern, wie z.B. im Hippocampus des Mausgehirns. Obwohl 3PM hauptsächlich in den Neurowissenschaften verwendet wird, kann 3PM möglicherweise in anderen Geweben wie Lymphknoten, Knochen und Tumoren zur Tiefengewebsbeobachtung angewendet werden.
Es ist wichtig zu überprüfen, ob das Bildgebungssystem nahe an der Schussrauschgrenze arbeitet, wodurch sichergestellt wird, dass die Erkennungs- und Datenerfassungselektronik nach den PMTs ein vernachlässigbares Rauschen zum Bild beiträgt. Die Unsicherheit in der Anzahl der detektierten Photonen wird durch Photonenschussrauschen grundlegend begrenzt. Eine begrenzte Leistung bei Schussrauschen kann in einem typischen Multiphotonenmikroskop mit einem Photodetektor mit hoher Verstärkung (z. B. einem PMT) erreicht werden. Das Photonenschussrauschen folgt einer statistischen Poisson-Verteilung, wobei die Standardabweichung der Verteilung gleich der Quadratwurzel des Mittelwerts der Verteilung ist. Führen Sie Schritt 1.14 im Protokollabschnitt aus, um die eingeschränkte Leistung des Aufnahmerauschens zu überprüfen.
Um eine Lichtdämpfung durch H2O zu vermeiden, ist die Verwendung vonD2Ozum Eintauchen hilfreich, insbesondere bei einer Anregung von ~1.700 nm. WennD2Overwendet wird, ist es wichtig, D 2 O alle ~ 10 Minuten zu aktualisieren oder ein großes Volumen von D 2 O zu verwenden, um einen Austausch von D2 O / H2O während der Bildgebung zu vermeiden. Man kann die D2O auch aus der Raumumgebung3 abdichten. Wenn für die Bildgebung ein Objektiv mit langem Arbeitsabstand (WD) (z. B. WD bei 4 mm oder länger) verwendet wird, kann die Dicke der Tauchflüssigkeit 2-3 mm überschreiten. Die erhöhte Dicke macht die H2O-Absorption auch bei ~1.300 nm21 nicht zu vernachlässigen. Daher kann D2O auch für 1.300 nm 3PM erforderlich sein, wenn ein langes WD-Objektiv verwendet wird.
Da die 3P-Fluoreszenzintensität vom Würfel der Anregungspulsenergie am Fokus abhängt (Gl. (1)), ist die Einstellung der entsprechenden Laserleistung besonders wichtig, um ausreichende 3P-Fluoreszenzsignale zu erhalten und gleichzeitig thermische und nichtlineare Schäden in lebendem Gewebe zu vermeiden. Die durchschnittliche Laserleistung sollte unter der thermischen Schadensschwelle gehalten werden. Im Gehirn der Maus zum Beispiel, um thermische Gewebeschäden zu vermeiden, sollte die durchschnittliche Leistung auf der Gehirnoberfläche der Maus bei oder unter ~ 100 mW für ~ 1.300 nm Anregung in einer Tiefe von 1 mm und mit einem Sichtfeld (FOV) von 230 μm x230 μm 21 gehalten werden. Ebenso sollte die durchschnittliche Leistung bei ~1.700 nm bei oder unter ~50 mW in ~1 mm Tiefe und einem FOV von ~230 μm x 230 μm gehalten werden (unveröffentlichte Daten). Um eine Anregungssättigung und mögliche nichtlineare Schäden zu vermeiden, sollte die Anregungsimpulsenergie bei ~ 1.300 nm bzw.~ 1.700 nm Anregung bei ~
1.300 nm gehalten werden.
Aufgrund der Lichtabsorption und -streuung in Geweben wird die Pulsenergie im Fokus nach dem Eindringen von Geweben durch 1 EAL auf 1/e (~ 37%) abgeschwächt. Die EAL variiert in verschiedenen Geweben und mit den Anregungswellenlängen, z.B. im Neokortex des Mausgehirns, beträgt die EAL ~300 μm und ~400 μm bei ~1.300 nm bzw. ~1.700 nm bzw. 3,29 (Abbildung 5). Um also die gleiche Pulsenergie im Fokus (z. B. 1 nJ / Puls) in einer Tiefe von n EALs zu halten, muss die Oberflächenpulsenergie mit 1 nJ × en multipliziert werden. Für eine schnelle Abbildung der Struktur- und Funktionsdynamik ist ein Anregungslaser mit einer hohen Wiederholrate (bei 1 MHz oder höher) wünschenswert, um eine hohe Bildratevon 5,6,7,10 zu erreichen. Der Pulsenergiebedarf und die durchschnittliche Laserleistungsgrenze schränken jedoch die anwendbare Wiederholrate ein.
Wenn wir beispielsweise einen mäßig tiefen Bereich bei 4 EALs (dh ~ 1,2 mm im Mauskortex mit 1.300 nm Anregung) abbilden, sind ~ 55 nJ / Puls an der Oberfläche erforderlich, um 1 nJ / Puls im Fokus zu halten. Wenn die durchschnittliche Leistungsbegrenzung 100 mW beträgt, können wir eine Laserwiederholrate von ~ 2 MHz anwenden. Um jedoch tiefer in einer Tiefe von 7 EALs zu fotografieren, sind ~ 1.100 nJ / Puls an der Oberfläche erforderlich, um 1 nJ / Puls im Fokus zu halten. Unter der Annahme, dass die maximale durchschnittliche Leistung 100 mW beträgt, um thermische Schäden zu vermeiden, sollte die Laserwiederholrate auf 0,1 MHz reduziert werden, um einen Puls von 1.100 nJ / Puls an der Oberfläche zu erreichen. Tabelle 1 fasst typische Bildgebungsbedingungen in der Hirnrinde der Maus zusammen. Beachten Sie, dass bei den Abbildungstiefen in Tabelle 1 davon ausgegangen wird, dass die EAL im gesamten Mauskortex einheitlich ist.
Darüber hinaus besteht aufgrund der Laserleistungsbegrenzung im Tiefengewebe 3PM ein Kompromiss zwischen der Bildrate und der Bildpixelgröße, der besonders für die funktionelle Bildgebung wie die Kalziumbildgebung wichtig ist. Die maximal verfügbare Laserwiederholrate wird in jeder Tiefe basierend auf der erforderlichen Pulsenergie im Fokus und der anwendbaren durchschnittlichen Laserleistung, wie oben diskutiert, festgelegt, z. B. 2 MHz in einer Tiefe, die ~ 4 EALs mit 1.300 nm Anregung entspricht. Im Allgemeinen erfordert die Bildgebung mindestens einen Impuls pro Pixel. Dementsprechend wird die minimal verfügbare Pixelverweilzeit durch die Laserwiederholrate bestimmt, z.B. 0,5 μs/Pixel bei 2 MHz Anregung.
Um die hohe räumliche Auflösung (~1 μm in lateral) in 3P-Bildern beizubehalten, ist es ideal, 1 Pixel auf eine Fläche von ~1 μm 2 einzustellen, z.B. 256 x 256 Pixel für ein FOV von 250 x 250 μm2. Um eine schnelle Bildgebung mit einem beträchtlich großen Sichtfeld (z. B. 250 x 250 μm 2 mit 256 x256 Pixeln), 0,5 MHz, 1 MHz und 2 MHz Pulswiederholraten durchzuführen, ergeben sich theoretische maximale Bildraten von ~ 7,6, ~ 15 bzw. ~ 30 Bildern / s. Ebenso ist die Optimierung der Laserwiederholrate in Abhängigkeit von der Zieltiefe, der Scangeschwindigkeit und dem FOV unerlässlich, um eine ausreichende Pulsenergie unterhalb der thermischen Schadensschwelle anzuwenden. Um die Bildgebungsgeschwindigkeit zu erhöhen, kann eine adaptive Erregungsquelle verwendet werden, um alle Erregungsimpulse auf die Neuronen (d.h. Regionen von Interesse) zu konzentrieren, indem Laserpulse bei Bedarf an die Neuronenabgegeben werden 31.
3PM ist vorteilhaft im Vergleich zu 2PM in der Tiefenbildgebung innerhalb lebender Gewebe und durch stark streuende Medien wie einen Schädel, Knochen und die weiße Substanzschicht (dh die äußere Kapsel) des Mausgehirns. Die längere EAL und die nichtlineare Anregung höherer Ordnung von 3PE kommen der Tiefengewebebildgebung zugute. Um beispielsweise GCaMP6 im Mauskortex abzubilden, ist das 2P-Fluoreszenzsignal mit einer Anregung von 920 nm höher als das 3P-Fluoreszenzsignal mit einer Anregung von 1.300 nm in flachen Regionen bei 690 μm (dh ~ 2,3 EALs bei 1.300 nm)21. Aufgrund der längeren EAL bei 1.300 nm im Vergleich zu 920 nm ergibt 3PE jedoch eine stärkere Fluoreszenz als die 2P-Anregung (2PE) in einer Tiefe von ~690 μm und tiefer 21. Diese Tiefe ist definiert als “Signalübergangstiefe”, bei der die Fluoreszenzsignalstärken von 2PE und 3PE mit der gleichen Wiederholrate und den gleichen maximal zulässigen Durchschnittsleistungenidentisch sind 21. Die Signalübergangstiefe hängt von den Anregungswellenlängen für 2PE und 3PE und dem Fluorophor ab.
In der Praxis ermöglicht die Anregung von 920 nm aufgrund der geringeren Wasseraufnahme eine höhere durchschnittliche Laserleistung als die Anregung von 1.300 nm. Die höhere durchschnittliche Leistung von 2PE würde die Signalübergangstiefe jedoch nur um 0,9 EALs4 erhöhen. Wenn die Probe dicht markiert ist, hat 3PE außerdem den zusätzlichen Vorteil einer viel höheren SBR. Daher kann 3PM bereits vor Erreichen der Signalübergangslänge besser für die Bildgebung sein als 2PM. Bei der Abbildung des Gehirngefäßsystems der Maus, das einen Volumenanteil (d. h. eine Markierungsdichte) von ~ 2% aufweist, übertrifft beispielsweise 1.300 nm 3PM mit 100 mW Erregungsleistung 920 nm 2PM mit 200 mW Anregungsleistung in einer Tiefe von ~ 700 μm für Fluorescein.
3PM hat auch einen Vorteil bei der Abbildung durch eine dünne, aber stark streuende Schicht, die die Punktspreizungsfunktion des Anregungsstrahls verzerren und einen Defokussierungshintergrund erzeugenkann 4. Zum Beispiel leiden 2PM-Bilder durch den intakten Schädel des Mausgehirns selbst in der geringen Tiefe von <100 μm von der Gehirnoberfläche 13 unter dem Defokussierungshintergrund. Ein ähnlicher Defokushintergrund wurde in 2PM mit 1.280 nm Anregung durch die weiße Substanz im Gehirn der Mausbeobachtet 32. Wenn Gewebe durch trüben Schichten abgebildet werden, ist daher 3PM für kontrastreiche Bildgebung unabhängig von der Markierungsdichte besser als 2PM.
Wir berichteten kürzlich über ein Perlenphantom und eine theoretische Analyse, die zeigt, dass die Bildtiefengrenze von 3PM über 8 EALs33 liegt; 8 EALs entsprechen ~3 mm mit ~1.700 nm Anregung im Mauskortex. Der derzeit verfügbare Laser hat jedoch nicht genug Pulsenergie, um 8 EALs im Gehirn der Maus zu erreichen. Die Weiterentwicklung stärkerer Laser wird die derzeitige Abbildungstiefengrenze von 3PM verschieben.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub und NIH 1U01NS103516 unterstützt.
5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |