Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels
Summary
Hier werden Tiermodelle auf der Basis von Maus und Kaninchen für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels entwickelt, um neue Therapeutika und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen.
Abstract
Hornhautverletzungen an der Augenoberfläche, einschließlich Verätzungen und Traumata, können schwere Narbenbildung, Symblepharon, Mangel an limbalen Stammzellen der Hornhaut und einen großen, anhaltenden Hornhautepitheldefekt verursachen. Epitheldefekte mit anschließender Hornhauttrübung und peripherer Neovaskularisation führen zu irreversiblen Sehstörungen und behindern die zukünftige Behandlung, insbesondere die Keratoplastik. Da das Tiermodell als effektive Plattform für die Entwicklung von Medikamenten genutzt werden kann, werden hier Modelle der Hornhautverletzung bei der Maus und der Alkaliverbrennung am Hornhautepithel von Kaninchen entwickelt. Das neuseeländische weiße Kaninchen wird im Modell der Alkaliverbrennung verwendet. Unterschiedliche Konzentrationen von Natriumhydroxid können unter intramuskulärer und topischer Anästhesie für 30 s auf den zentralen kreisförmigen Bereich der Hornhaut aufgetragen werden. Nach ausgiebiger isotonischer normaler Kochsalzspülung wurde das verbleibende lose Hornhautepithel mit Hornhautgrat bis tief in die Bowman-Schicht innerhalb dieses kreisförmigen Bereichs entfernt. Die Wundheilung wurde durch Fluoresceinfärbung unter kobaltblauem Licht dokumentiert. C57BL/6-Mäuse wurden im traumatischen Modell des murinen Hornhautepithels verwendet. Die zentrale Hornhaut der Maus wurde mit einer Hautstanze mit einem Durchmesser von 2 mm markiert und dann mit einem Hornhautrostentferner mit einem 0,5 mm Grat unter einem Stereomikroskop debridiert. Diese Modelle können prospektiv verwendet werden, um die therapeutische Wirkung von Augentropfen oder Mischwirkstoffen wie Stammzellen zu validieren, die möglicherweise die Regeneration des Hornhautepithels erleichtern. Durch die Beobachtung der Hornhauttrübung, der peripheren Neovaskularisation und der Bindehautstauung mit Stereomikroskop und Bildgebungssoftware können die therapeutischen Effekte in diesen Tiermodellen überwacht werden.
Introduction
Die menschliche Hornhaut besteht aus fünf Hauptschichten und spielt eine zentrale Rolle bei der Augenrefraktion, um die Sehschärfe und strukturelle Integrität zum Schutz des intraokularen Gewebes zu erhalten1. Der äußerste Teil der Hornhaut ist das Hornhautepithel, das aus fünf bis sechs Zellschichten besteht, die sich nacheinander von den Basalzellen differenzieren und sich nach oben bewegen, um sich von der Augenoberfläche abzulösen1. Im Vergleich zur Hornhaut beim Menschen und beim neuseeländischen Kaninchen hat die Hornhaut der Maus eine ähnliche Hornhautstruktur, ist aber aufgrund einer geringeren Dicke des Epithels und des Stromas dünner peripher als der zentrale Teil2. Aufgrund seiner einzigartigen Position im optischen System des Auges können viele äußere Beeinträchtigungen wie mechanische Verletzungen, bakterielle Inokulation und chemische Mittel leicht die Integrität des Epithels gefährden und darüber hinaus zu sehbedrohenden Epitheldefekten, infektiöser Keratitis, Hornhautschmelze und sogar Hornhautperforation führen.
Obwohl bereits verschiedene Therapeutika wie Gleitmittel, Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, Autoserumprodukte und Amnionmembranen eingesetzt wurden, um die Reepithelialisierung zu verbessern und die Narbenbildung zu reduzieren, werden andere potenzielle Behandlungsmodalitäten, die die Wundheilung ermöglichen, Entzündungen reduzieren und die Narbenbildung unterdrücken können, noch auf verschiedenen Plattformen entwickelt und getestet. Es wurden verschiedene Tiermodelle für die Wundheilung des Hornhautepithels vorgeschlagen, darunter die Entfernung des Hornhautepithels mit einem Hornhautrostentferner bei der diabetischen Maus3, lineare Kratzer über dem Hornhautepithel der Maus mit einer sterilen 25-G-Nadel zur bakteriellen Inokulation4, die trepangestützte Entfernung des Hornhautepithels mit dem Hornhautrostentferner5, die Epithelkätzung über die Hälfte der Hornhaut und den Limbus6 , Trepan-erleichterte Hornhautabrieb von Kaninchen durch eine stumpfe Skalpellklinge7 und Hornhautverletzung bei Rindern durch Schockfrosten in flüssigem Stickstoff8.
Neben der mechanischen Verletzung des Hornhautepithels sind auch chemische Mittel häufige Beleidigungen der Augenoberfläche, insbesondere saure und alkalische Mittel. Natriumhydroxid (NaOH, 0,1-1 N für 30-60 s) ist eine der am häufigsten verwendeten Chemikalien in Maus- und Kaninchenmodellen der Hornhautverbrennung 9,10,11,12,13. 100%iges Ethanol war auch im Verätzungsmodell der Ratte auf die Hornhaut aufgetragen worden, gefolgt von einer zusätzlichen mechanischen Verschrottung unter Verwendung einer chirurgischen Klinge14. Da die Aufrechterhaltung einer gesunden Augenoberfläche von funktionellen Einheiten abhängt, einschließlich der Augenlider, Meibom-Drüsen, des Tränensystems, der Bindehaut und der Hornhaut, haben In-vivo-Tiermodelle einige Vorteile gegenüber ex vivo kultivierten Hornhautepithelzellen oder Hornhautgeweben. In diesem Artikel werden das Mausmodell der Hornhautabriebwunde und das Kaninchenmodell der Hornhautalkaliverbrennung demonstriert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maus- und Kaninchenmodelle von Hornhautverletzungen bieten eine nützliche Ex-vivo- und In-vivo-Plattform für die Überwachung der Wundheilung, die Erprobung neuer Therapeutika und die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der Wundheilung und der Behandlungswege. Für ein Kurzzeit- oder Langzeitexperiment können je nach Forschungszweck unterschiedliche Tiermodelle verwendet werden. Zum Beispiel könnte nach der Erzeugung eines Epitheldefekts auf der Hornhaut von Mäusen in vivo ein …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde vom Atomic Energy Council of Taiwan (Förderkennzeichen A-IE-01-03-02-02), dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (Förderkennzeichen NMRPG3E6202-3) und dem Chang Gung Medical Research Project (Förderkennzeichen CMRPG3H1281) finanziert.
Materials
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
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