विकेंद्रीकृत, कम लागत और उच्च क्षमता वाले निदान तक पहुंच जिसे विकेंद्रीकृत परीक्षण के लिए समुदाय में तैनात किया जा सकता है, वैश्विक स्वास्थ्य संकटों का मुकाबला करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह पांडुलिपि बताती है कि वायरल आरएनए अनुक्रमों के लिए पेपर-आधारित निदान कैसे बनाया जाए जिसे पोर्टेबल ऑप्टिकल रीडर के साथ पता लगाया जा सकता है।
कम बोझ वाले आणविक निदान तक पहुंच जिसे परीक्षण के लिए समुदाय में तैनात किया जा सकता है, तेजी से महत्वपूर्ण है और समाजों और आर्थिक स्थिरता की भलाई के लिए सार्थक व्यापक प्रभाव है। हाल के वर्षों में तेजी से, कम लागत वाले आणविक निदान की आवश्यकता को पूरा करने के लिए कई नए इज़ोटेर्मल नैदानिक तौर-तरीके उभरे हैं। हमने मच्छर जनित जीका और चिकनगुनिया वायरस के निदान सहित टोहोल्ड स्विच-आधारित डायग्नोस्टिक्स के विकास और रोगी सत्यापन के माध्यम से इस प्रयास में योगदान दिया है, जिसने गोल्ड-स्टैंडर्ड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) आधारित परख के बराबर प्रदर्शन प्रदान किया है। ये निदान विकसित करने और निर्माण करने के लिए सस्ती हैं, और उनके पास कम संसाधन वातावरण को नैदानिक क्षमता प्रदान करने की क्षमता है। यहां प्रोटोकॉल जीका वायरस का पता लगाने के लिए स्विच-आधारित परख के विकास के लिए आवश्यक सभी कदम प्रदान करता है। लेख पाठकों को चरणबद्ध नैदानिक विकास प्रक्रिया के माध्यम से ले जाता है। सबसे पहले, जीका वायरस के जीनोमिक अनुक्रम ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके उम्मीदवार स्विच के कम्प्यूटेशनल डिज़ाइन के लिए इनपुट के रूप में काम करते हैं। इसके बाद, सिंथेटिक आरएनए अनुक्रमों के साथ अनुभवजन्य स्क्रीनिंग और नैदानिक संवेदनशीलता के अनुकूलन के लिए सेंसर की असेंबली दिखाई गई है। एक बार पूरा होने के बाद, सत्यापन आरटी-क्यूपीसीआर के समानांतर रोगी के नमूनों के साथ किया जाता है, और एक उद्देश्य-निर्मित ऑप्टिकल रीडर, प्लम। यह काम मानव स्वास्थ्य, कृषि और पर्यावरण निगरानी में अनुप्रयोगों के लिए कम लागत वाले टोहोल्ड स्विच-आधारित सेंसर के विकास के लिए शोधकर्ताओं को एक तकनीकी रोडमैप प्रदान करता है।
आरटी-क्यूपीसीआर अपनी उत्कृष्ट संवेदनशीलता और विशिष्टता के कारण नैदानिक निदान के लिए स्वर्ण मानक तकनीक बनी हुई है। हालांकि अत्यधिक मजबूत, विधि महंगे, विशेष उपकरणों और अभिकर्मकों पर निर्भर करती है जिन्हें तापमान-नियंत्रित वितरण और भंडारण की आवश्यकता होती है। यह विश्व स्तर पर गुणवत्ता निदान की पहुंच के लिए महत्वपूर्ण बाधाएं प्रस्तुत करता है, विशेष रूप से रोग के प्रकोप के समय में और उन क्षेत्रों में जहां अच्छी तरह से सुसज्जित प्रयोगशालाओं तकपहुंच सीमित है। यह ब्राजील में 2015/2016 के जीका वायरस के प्रकोप के दौरान देखा गया था। आरटी-क्यूपीसीआर परीक्षण प्रदान करने के लिए केवल पांच केंद्रीकृत प्रयोगशालाएं उपलब्ध होने के कारण, महत्वपूर्ण बाधाएं हुईं, जिससे निदान तक पहुंच सीमित हो गई। यह पेरी-शहरी सेटिंग्स में व्यक्तियों के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण था, जो प्रकोप 3,4 से अधिक गंभीर रूप से प्रभावित थे। डायग्नोस्टिक्स तक पहुंच में सुधार करने के प्रयास में, प्रोटोकॉल एक मंच दिखाता है जिसे कम-संसाधन सेटिंग्स में विकेंद्रीकृत, कम लागत और उच्च क्षमता वाले निदान प्रदान करने की क्षमता के साथ विकसित किया गया है। इसके एक भाग के रूप में, एक नैदानिक खोज पाइपलाइन स्थापित की गई थी, पेपर-आधारित सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली 5,6 के साथ इज़ोटेर्मल प्रवर्धन और सिंथेटिक आरएनए स्विच-आधारित सेंसर को युग्मित करना।
सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) सिस्टम, विशेष रूप से ई कोलाई आधारित सेल-मुक्त सिस्टम, पर्यावरण निगरानी7,8 से रोगज़नक़ निदान 5,6,9,10,11,12 तक बायोसेंसिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक आकर्षक मंच है . प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए आवश्यक घटकों को शामिल करते हुए, सीएफपीएस सिस्टम में पूरे सेल बायोसेंसर पर महत्वपूर्ण फायदे हैं। विशेष रूप से, संवेदन एक सेल की दीवार तक सीमित नहीं है और, सामान्य तौर पर, वे डिजाइन में मॉड्यूलर, बायोसेफ, सस्ती हैं, और पोर्टेबल उपयोग के लिए फ्रीज-सुखाया जा सकता है। कागज या वस्त्र जैसे सब्सट्रेट्स पर फ्रीज-ड्राई जीन सर्किट-आधारित प्रतिक्रियाओं की क्षमता, परिवहन, कमरे के तापमान5 पर दीर्घकालिक भंडारण और यहां तक कि पहनने योग्य तकनीक13 में शामिल करने में सक्षम बनाती है।
पिछले काम से पता चला है कि ई कोलाई सेल-मुक्त प्रणालियों का उपयोग कई विश्लेषणों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, पारा जैसे विषाक्त धातु, टेट्रासाइक्लिन 7,14 जैसे एंटीबायोटिक्स, अंतःस्रावी-विघटनकारी रसायन15,16, हिप्पुरिक एसिड17, रोगज़नक़ से जुड़े कोरम सेंसिंग अणु 9,18 और कोकीन 17, और गामाब्यूटिरेट (जीएचबी) 19 जैसे अवैध पदार्थ . न्यूक्लिक एसिड के अनुक्रम-विशिष्ट पहचान के लिए, रणनीतियों ने अधिकांश भाग के लिए इज़ोटेर्मल प्रवर्धन तकनीकों के साथ युग्मित स्विच-आधारित बायोसेंसर के उपयोग पर भरोसा किया है। टोहोल्ड स्विच सिंथेटिक राइबोरेग्यूलेटर हैं (जिसे बाकी पाठ में केवल ‘स्विच’ भी कहा जाता है) जिसमें एक हेयरपिन संरचना होती है जो राइबोसोमल बाइंडिंग साइट (आरबीएस) और स्टार्ट कोडन को अनुक्रमित करके डाउनस्ट्रीम अनुवाद को अवरुद्ध करती है। उनके लक्ष्य ट्रिगर आरएनए के साथ बातचीत पर, हेयरपिन संरचना से राहत मिलती है और एक रिपोर्टर ओपन रीडिंग फ्रेम का बाद मेंअनुवाद सक्षम होता है।
इज़ोटेर्मल प्रवर्धन का उपयोग आणविक निदान21 के रूप में भी किया जा सकता है; हालांकि, ये विधियां निरर्थक प्रवर्धन के लिए प्रवण हैं, जो विशिष्टता को कम कर सकती हैं और इस प्रकार आरटी-क्यूपीसीआर 22 से नीचे परीक्षण की सटीकता हो सकती है। यहां रिपोर्ट किए गए काम में, स्विच-आधारित सेंसर के अपस्ट्रीम इज़ोटेर्मल प्रवर्धन का उपयोग संयुक्त सिग्नल प्रवर्धन प्रदान करने के लिए किया गया था जो न्यूक्लिक एसिड (फेम्टोमोलर से एटोमोलर) का नैदानिक रूप से प्रासंगिक पता लगाने में सक्षम बनाता है। दो विधियों की यह जोड़ी दो अनुक्रम-विशिष्ट चौकियों को भी प्रदान करती है, जो संयोजन में, उच्च स्तर की विशिष्टता प्रदान करती हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, पिछले काम ने जीका6, इबोला5, नोरोवायरस10 जैसे वायरस का पता लगाने के साथ-साथ रोगजनक बैक्टीरिया जैसे सी डिफिसाइल23 और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी टाइफाइड12 का पता लगाया है। हाल ही में, कोविड-19महामारी 11,12,13 के लिए सुलभ निदान प्रदान करने के प्रयासों में सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए सेल-फ्री टोहोल्ड स्विच का प्रदर्शन किया गया है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल जीका वायरस का पता लगाने के लिए सेल-फ्री, पेपर-आधारित सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच परख के विकास और सत्यापन को रेखांकित करता है, सिलिको बायोसेंसर डिजाइन में, असेंबली और अनुकूलन चरणों के माध्यम से, रोगी के नमूनों के साथ क्षेत्र सत्यापन के लिए। प्रोटोकॉल जीका वायरल आरएनए के लिए विशिष्ट आरएनए टोहोल्ड स्विच-आधारित सेंसर और आइसोथर्मल प्रवर्धन प्राइमरों के सिलिको डिजाइन के साथ शुरू होता है। यद्यपि कई आइसोथर्मल प्रवर्धन विधियां मौजूद हैं, यहां प्रतिक्रिया में मौजूद वायरल आरएनए लक्ष्य की एकाग्रता को बढ़ाने के लिए न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन (एनएएसबीए) का उपयोग किया गया था, जिससे चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया गया था। व्यावहारिक रूप से, आइसोथर्मल प्रवर्धन विधियों में एक निरंतर तापमान पर काम करने का लाभ होता है, जिससे थर्मल साइकिलर्स जैसे विशेष उपकरणों की आवश्यकता समाप्त हो जाती है, जो आम तौर पर केंद्रीकृत स्थानों तक सीमित होते हैं।
इसके बाद, ओवरलैप एक्सटेंशन पीसीआर के माध्यम से रिपोर्टर कोडिंग अनुक्रमों के साथ सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच सेंसर को इकट्ठा करने की प्रक्रिया, और सिंथेटिक आरएनए का उपयोग करके सेल-मुक्त प्रणालियों में इष्टतम प्रदर्शन के लिए सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच सेंसर की जांच का वर्णन किया गया है। जीका वायरस सेंसर के इस सेट के लिए, हमने β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम को एन्कोडिंग करने वाले लैकजेड जीन का चयन किया है, जो एक रंगीन सब्सट्रेट, क्लोरोफेनॉल रेड-β-डी-गैलेक्टोपाइरानोसाइड (सीपीआरजी) को छोड़ने में सक्षम है, ताकि पीले से बैंगनी रंग में परिवर्तन हो सके जिसे आंखों द्वारा या प्लेट रीडर के साथ पता लगाया जा सकता है। एक बार शीर्ष प्रदर्शन करने वाले सिंथेटिक स्विच की पहचान हो जाने के बाद, सबसे अच्छी संवेदनशीलता प्रदान करने वाले सेटों को खोजने के लिए सिंथेटिक आरएनए का उपयोग करके संबंधित लक्ष्य अनुक्रम के न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम-आधारित आइसोथर्मल प्रवर्धन के लिए प्राइमरों की स्क्रीनिंग की प्रक्रिया का वर्णन किया गया है।
अंत में, नैदानिक मंच का प्रदर्शन लैटिन अमेरिका (चित्रा 1) में साइट पर मान्य है। नैदानिक नैदानिक सटीकता निर्धारित करने के लिए, रोगियों से जीका वायरस के नमूनों का उपयोग करके पेपर-आधारित सेल-मुक्त परख की जाती है; समानांतर में तुलना के लिए एक स्वर्ण मानक आरटी-क्यूपीसीआर परख किया जाता है। कलरमेट्रिक सेल-फ्री परख की निगरानी करने के लिए, हम उन क्षेत्रों में परिणामों की ऑन-साइट मात्रा का निर्धारण सक्षम करते हैं जहां थर्मल साइकिलर्स उपलब्ध नहीं हैं। पोर्टेबल, कम लागत, उपयोगकर्ता के अनुकूल, मल्टीमॉडल (प्लम; इसके बाद पोर्टेबल प्लेट रीडर के रूप में संदर्भित) नामक हाथ से इकट्ठे प्लेट रीडर को भी यहां पेश कियागया है। प्रारंभ में सेल-मुक्त सिंथेटिक टोहोल्ड स्विच डायग्नोस्टिक्स के लिए एक साथी उपकरण के रूप में विकसित, पोर्टेबल प्लेट रीडर उच्च-थ्रूपुट तरीके से परिणामों को इनक्यूबेट करने और पढ़ने का एक सुलभ तरीका प्रदान करता है, जो उपयोगकर्ताओं के लिए एकीकृत, कंप्यूटर दृष्टि-आधारित सॉफ्टवेयर विश्लेषण प्रदान करता है।
चित्रा 1: पेपर-आधारित सेल-फ्री टोहोल्ड स्विच प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके रोगी के नमूनों के परीक्षण के लिए वर्कफ़्लो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
यहां वर्णित संयुक्त पेपर-आधारित प्रणाली चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक आणविक निदान ला सकती है, प्रदर्शन के साथ जो कार्यात्मक रूप से आरटी-क्यूपीसीआर के बराबर है, आवश्यकता के बिंदु6 तक। महत्वपूर्ण रूप से, दूरस्थ सेटिंग्स के लिए, साइट पर निदान की उपलब्धता परिणामों के समय को दिनों से घंटों तक कम कर सकती है। इस दृष्टिकोण की प्रोग्रामेबिलिटी पर प्रकाश डालते हुए, वर्णित पाइपलाइन का उपयोग लगभग किसी भी रोगज़नक़ लक्ष्य का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। हमने आणविक उपकरणों को एक उद्देश्य-निर्मित पोर्टेबल प्लेट रीडर के साथ जोड़ा है, जो बैटरी ऑपरेशन (8-9 घंटे) के साथ कॉम्पैक्ट और संगत है और वितरित अनुप्रयोगों को सक्षम करने के लिए ऑनबोर्ड डेटा विश्लेषण प्रदान करता है। अन्य काम में, हमने आरटी-क्यूपीसीआर के समानांतर 268 रोगी नमूनों के साथ संयुक्त हार्डवेयर और जीका वायरस डायग्नोस्टिक प्लेटफॉर्म को मान्य किया है, और 98.5% 24 की नैदानिक सटीकता पाई है। एक साथ लिया गया, हमारा लक्ष्य शोधकर्ताओं को इस मंच के प्रौद्योगिकी हस्तांतरण को सक्षम करना है ताकि इसे समुदाय द्वारा अपूर्ण नैदानिक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए पुनर्निर्मित और बेहतर बनाया जा सके।
इनसिलिको टोहोल्ड स्विच डिजाइन प्रक्रिया को एक पाइपलाइन में एकीकृत और स्वचालित किया गया है जिसे तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है। पहला चरण टोहोल्ड स्विच डिज़ाइनों का एक पूल उत्पन्न करता है जो एक न्यूक्लियोटाइड वेतन वृद्धि में लक्ष्य अनुक्रम में संकरण करता है। दूसरा चरण द्वितीयक संरचना और टोहोल्ड स्विच उपलब्धता की जांच करता है और इन-फ्रेम प्रीमैच्योर स्टॉप कोडन के साथ सेंसर को समाप्त करता है। एक स्कोरिंग फ़ंक्शन जो कई कारकों (जैसे, टोहोल्ड स्विच का दोष स्तर, टोहोल्ड स्विच उपलब्धता और लक्ष्य साइट पहुंच) पर विचार करता है, फिर समग्र स्कोर के आधार पर शीर्ष टोहोल्ड स्विच डिज़ाइन का चयन करने के लिए लागू किया जाता है। अंतिम चरण में, शीर्ष टोहोल्ड स्विच डिजाइन और उनके संबंधित लक्ष्य ट्रिगर्स के लिए अनुक्रमों की एक सूची उत्पन्न की जाती है। एनसीबीआई/प्राइमर-ब्लास्ट25 का उपयोग करके मानव ट्रांसक्रिपटम और निकटता से संबंधित वायरल जीनोम के खिलाफ विशिष्टता के लिए शीर्ष सेंसर अनुक्रमों की जांच की जानी चाहिए। जीका वायरल जीनोम में अनुक्रम संरक्षण के लिए सेंसर लक्ष्य साइटों को स्क्रीन करना भी सबसे अच्छा अभ्यास है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेंसर व्यापक और मजबूत पहचान प्रदान करेंगे। टोहोल्ड स्विच डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर के कई संस्करण विकसित किए गए हैं और डिज़ाइन एल्गोरिदम उपयोगकर्ताओं को दो संस्करण उत्पन्न करने की अनुमति देता है, या तो श्रृंखला ए6 या श्रृंखला बी टोहोल्ड स्विच6। इस लेख में, श्रृंखला बी टोहोल्ड स्विच डिजाइन पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
वाणिज्यिक डीएनए संश्लेषण के बाद, टोहोल्ड स्विच को तेजी से इकट्ठा किया जा सकता है, और फिर सिंथेटिक लक्ष्य ट्रिगर अनुक्रम के खिलाफ प्रारंभिक स्क्रीन करके परीक्षण किया जा सकता है जो लक्ष्य जीनोम के छोटे क्षेत्रों (200-300 एनटी) से मेल खाता है। टोहोल्ड स्विच-आधारित सेंसर के प्रदर्शन की स्क्रीनिंग के लिए, आरएनए के रूप में लक्ष्य अनुक्रम जोड़ना आदर्श है। इस लेख में, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड ट्रिगर आरएनए को जोड़ने के लिए आवश्यक चरणों को रेखांकित किया गया है। हालांकि, यदि उपलब्ध हो, तो पूर्ण लंबाई वाले जीनोम टेम्प्लेट जैसे कि मात्रात्मक वायरल आरएनए अर्क या वाणिज्यिक सिंथेटिक आरएनए जीनोम या मानकों का उपयोग किया जा सकता है। प्रारंभिक टोहोल्ड स्विच स्क्रीनिंग के लिए पूर्ण लंबाई वाले आरएनए जीनोम का उपयोग करना फायदेमंद है क्योंकि यह सूचित कर सकता है कि अतिरिक्त कारक, जैसे कि आरएनए माध्यमिक संरचना, सेंसर प्रदर्शन को प्रभावित करेगी या नहीं। उम्मीदवार स्विच के ऑन / ऑफ अनुपात को अनुकूलित करने के लिए, टोहोल्ड स्विच डीएनए को सेल-मुक्त प्रतिक्रिया में टाइट किया जा सकता है। यह कदम डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन चरणों से उच्च प्रदर्शन वाले टोहोल्ड स्विच (फोल्ड प्रवर्धन, या उच्च ऑन / ऑफ अनुपात) की पहचान करने और लीक टोहोल्ड स्विच (लक्ष्य आरएनए की अनुपस्थिति में उच्च संकेत) को छोड़ने के लिए भी काम कर सकता है।
शीर्ष प्रदर्शन करने वाले टोहोल्ड स्विच उम्मीदवारों का पता लगाने की सीमा में सुधार करने के लिए, एनएएसबीए का उपयोग लक्षित जीका वायरल आरएनए की नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता को एक स्तर तक बढ़ाने के लिए किया जाता है जिसे टोहोल्ड स्विच6 द्वारा पता लगाया जा सकता है। नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर पता लगाने में सक्षम करने के लिए सर्वश्रेष्ठ एनएएसबीए प्राइमर और टोहोल्ड स्विच संयोजनों को निर्धारित करने के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर सेट के विभिन्न संयोजनों की जांच की जाती है। एक बार एक आदर्श प्राइमर सेट और टोहोल्ड स्विच संयोजन की पहचान हो जाने के बाद, परख को नैदानिक सत्यापन के लिए आगे बढ़ाया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टोहोल्ड स्विच और एनएएसबीए स्क्रीनिंग चरण श्रम और संसाधन-गहन हो सकते हैं और इसलिए परीक्षण विकास अच्छी तरह से संसाधन वाले अनुसंधान साइटों के लिए सबसे उपयुक्त है। यद्यपि हमने प्रक्रिया स्वचालन लागू नहीं किया है, यह संभावना है कि यह पुनरावृत्ति डिजाइन, निर्माण और परीक्षण चक्र32 में तेजी ला सकता है। सौभाग्य से, सेंसर डिजाइन और परीक्षण से तैनाती तक का टर्नअराउंड समय उल्लेखनीय रूप से कम (एक सप्ताह से कम) हो सकता है, जिससे इस रणनीति को समय-महत्वपूर्ण स्थितियों के लिए आदर्श बनाया जा सकता है, जैसे कि महामारी का प्रकोप6.
चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक संवेदनशीलता के साथ एक बायोसेंसर विकसित होने के बाद भी, तकनीकी चुनौतियां हैं जिन्हें संबोधित करने की आवश्यकता है। चूंकि इस प्रोटोकॉल में मैन्युअल ऑपरेशन शामिल है और यह एक बहु-चरण प्रक्रिया है, इसलिए नमूनों के बीच क्रॉस संदूषण का खतरा है। हम सावधानीपूर्वक प्रयोगशाला अभ्यास के माध्यम से इस जोखिम को कम करने की पूरी कोशिश करते हैं। 268 रोगी नमूनों के हालिया नैदानिक परीक्षण में, हमें किसी भी संदूषण के मुद्दों का सामना नहीं करना पड़ा; तथापि, यह एक महत्वपूर्ण विचारहै। इसे ध्यान में रखते हुए, प्रोटोकॉल एक प्रयोगशाला परख बना हुआ है और उचित आणविक जीव विज्ञान तकनीकों की कमान के साथ एक कुशल उपयोगकर्ता की आवश्यकता होती है। तैनाती के लिए एक अतिरिक्त विचार रोगी के नमूनों से आरएनए अलगाव है। यहां हम कॉलम-आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट का उपयोग करके आरएनए अलगाव का वर्णन करते हैं। हालांकि, अन्य काम में, हमने कम बोझ वाले रोगी नमूना प्रसंस्करण 6 के लिए एक प्रभावी और सरल उबलते लाइसिस विधि (2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस) का प्रदर्शनकिया है। यह रणनीति आरएनए निष्कर्षण से जुड़ी लागत को लगभग समाप्त कर देती है और कॉलम-आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट के उपयोग से बचती है, जो कोविड-19 महामारी जैसे संकटों के दौरान कम-संसाधन सेटिंग्स या आपूर्ति श्रृंखला के मुद्दों में लॉजिस्टिक चुनौती पैदा कर सकतीहै।
जैसा कि हमने कोविड-19 महामारी के दौरान देखा है, आरटी-क्यूपीसीआर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण स्वयं एक अड़चन के रूप में काम कर सकते हैं और परीक्षण के लिए रोगी की पहुंच को सीमित कर सकते हैं। यह कारक, जो काफी हद तक वित्तीय भी है, एक केंद्रीकृत परीक्षण मोड की ओर जाता है जो नैदानिक पहुंच को सीमित कर सकता है। उदाहरण के लिए, 2015/2016 के जीका प्रकोप के दौरान, ब्राजील में केवल पांच राष्ट्रीय संदर्भ प्रयोगशालाएं उपलब्ध थीं, जिसके कारण रोगी परीक्षण में देरी हुई। पैमाने की अर्थव्यवस्थाओं के संभावित लाभ पर विचार किए बिना, पोर्टेबल प्लेट रीडर के लिए माल की वर्तमान लागत ~ $ 500 अमरीकी डालर है, जो श्रम और वाणिज्यिक मार्जिन के लिए पांच गुना बढ़ने पर भी एक किफायती साधन प्रदान करती है। यह आरटी-क्यूपीसीआर उपकरणों की तुलना में अच्छी तरह से तुलना करता है जिनकी लागत $ 15,000- $ 90,000 अमरीकी डालर34 से होती है। इसके अलावा, लैटिन अमेरिका में सेल-मुक्त परख के लिए प्रति परीक्षण अनुमानित लागत लगभग $ 5.48 अमरीकी डालर है, जबकि ब्राजील में आरटी-क्यूपीसीआर के प्रति परीक्षण की लागत जीका प्रकोप के समय ~ $ 10-11अमरीकी डालर थी। उपकरण की लागत से परे, पोर्टेबल प्लेट रीडर में एक छोटा पदचिह्न (20 सेमी3), स्वचालित विश्लेषण, इंटरनेट के माध्यम से क्लाउड पर डेटा अपलोड होता है, और बैटरी पावर पर चलाया जा सकता है। ये विशेषताएं नाटकीय रूप से संभावित सेटिंग्स का विस्तार करती हैं जहां परीक्षण तैनात किया जा सकता है और सहवर्ती रूप से रोगी आबादी का विस्तार करता है जिसे सेवा दी जा सकती है।
आज तक सबसे आम वाणिज्यिक ई कोलाई सीएफपीएस प्लेटफॉर्म एस 30 और प्योर सिस्टम37 हैं; हालांकि, निम्न और मध्यम आय वाले देशों में निदान तक पहुंच में सुधार करने में एक महत्वपूर्ण विचार इन अभिकर्मकों की सीमित घरेलू उपलब्धता है। इस चुनौती को हल करने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम स्थानीय सीएफपीएस उत्पादन का विकास है। फेडेरिकी लैब ने हाल ही में लाइसेट-आधारित सेल-फ्री सिस्टम में टोहोल्ड स्विच-आधारित सेंसर को लागू करने के लिए एक गैर-वाणिज्यिक मंच विकसित करने की दिशा में महत्वपूर्ण प्रगति की है, जो जीका वायरस आरएनए14 के साथ 2.7 एफएम एलओडी तक पहुंच गया है। न केवल यह उपलब्धि अभिकर्मकों को उपयोग के देश में बनाने की अनुमति देती है, आयात शुल्क और देरी से बचती है, बल्कि श्रम लागत भी स्थानीय दरों को बढ़ाती है और इस प्रकार समग्र लागत को काफी कम किया जा सकता है। फेडेरिकी समूह द्वारा उल्लिखित काम में, चिली में सीएफपीएस अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया (5 μL) के उत्पादन की लागत 6.9 सेंट (USD) 35,38 थी, जो लाइसेट-आधारितप्रणालियों को लागू करने के लिए दोहरी प्रोत्साहन (बेहतर रसद और लागत) प्रदान करती थी।
वितरित नैदानिक नेटवर्क में आरटी-क्यूपीसीआर-तुलनीय परीक्षण का प्लेसमेंट वर्तमान प्रथाओं पर महत्वपूर्ण लाभ ला सकता है जो केंद्रीकृत आरटी-क्यूपीसीआर सुविधाओं में नमूनों के परिवहन पर निर्भर हैं। पेरी-अर्बन सेटिंग्स में, जहां जीका के मामले केंद्रित थे, एक रोगी और नैदानिक सुविधा के बीच शारीरिक दूरी निदान को धीमा कर देती है और जोखिम को बढ़ाती है कि परिणाम नैदानिक रूप से प्रासंगिक समय पर रोगी तक नहीं पहुंचेंगे। यह हमारी आशा है कि यहां प्रस्तुत कार्य मानव स्वास्थ्य, कृषि और पर्यावरण निगरानी के लिए विकेंद्रीकृत जैव प्रौद्योगिकी और पोर्टेबल हार्डवेयर बनाने के लिए ज्ञान के हस्तांतरण के माध्यम से अनुसंधान समुदाय को सक्षम करने में योगदान दे सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक ग्रीन, पारडी और पेना प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों के साथ-साथ इस पांडुलिपि में प्रकट किए गए काम से संबंधित पिछली पांडुलिपियों के सभी सह-लेखकों को धन्यवाद देते हैं। एस.जे.आर.डी.एस. को फाउंडेशन फॉर साइंस एंड टेक्नोलॉजी ऑफ परनामबुको (फेसपे), ब्राजील द्वारा प्रायोजित पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, संदर्भ संख्या आईबीपीजी-1321-2.12/18, और वर्तमान में टोरंटो विश्वविद्यालय, कनाडा द्वारा प्रायोजित पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित है। पीबी को फार्मेसी संकाय, टोरंटो विश्वविद्यालय से विलियम नैप बकले पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया है। एम.के. को टोरंटो विश्वविद्यालय के आंतरिक फैलोशिप नंबर पीआरएमएफ 2019-002 में प्रेसिजन मेडिसिन इनिशिएटिव (पीआरआईएमई) द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को कनाडा रिसर्च चेयर्स प्रोग्राम (फाइल 950-231075 और 950-233107), टोरंटो विश्वविद्यालय के प्रमुख अनुसंधान परियोजना प्रबंधन कोष, सीआईएचआर फाउंडेशन अनुदान कार्यक्रम (201610एफडीएन-375469) और एलपी, एएजी और केपी से केपी को सीआईएचआर / आईडीआरसी टीम ग्रांट के माध्यम से धन द्वारा समर्थित किया गया था। 149783), साथ ही कनाडा के अंतर्राष्ट्रीय विकास अनुसंधान केंद्र (अनुदान 109434-001) से कनाडाई 2019 नॉवल कोरोनावायरस (सीओवीआईडी -19) रैपिड रिसर्च फंडिंग अपॉर्च्युनिटी के माध्यम से केपी को धन द्वारा। इस काम को एरिजोना बायोमेडिकल रिसर्च कमीशन न्यू इन्वेस्टिगेटर अवार्ड (एडीएचएस 16-162400), गेट्स फाउंडेशन (ओपीपी 1160667), एनआईएच निदेशक का नया इनोवेटर अवार्ड (1डीपी2जीएम126892), एनआईएच आर 21 पुरस्कार (1आर21एआई136571-01ए1) से ए.ए.जी. चित्रा 1 केपी को अकादमिक लाइसेंस के तहत Biorender.com के साथ बनाया गया था।
384 well plate covers – aluminum | Sarstedt | 95.1995 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader |
384 well plate covers – transparent | Sarstedt | 95.1994 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader |
384 well plates | VWR | CA11006-180 | 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification |
Agarose | BioShop Canada | AGA001.500 | Gel electrophoresis |
BSA | BioShop Canada | ALB001.500 | Blocking agent for the Whatman filter paper |
Cell free reactions | New England Biolabs | E6800L | PURExpress |
CPRG | Roche | 10884308001 | Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside |
Disposable Sterile Biopsy Punches | Integra Miltex | 23233-31 | Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate |
DNAse I | Thermo Scientific | K2981 | Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction |
DNAse I Kit | Thermo Scientific | 74104 | DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA |
dNTPs | New England Biolabs | N0446S | Used for PCRs |
electrophoresis system | Bio-Rad | 1704487 | Used to run the agarose gels |
Gel imaging station | Bio-Rad | 1708265 | ChemiDoc XRS+ Imaging System |
IVT kit | New England Biolabs | E2040S | Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening |
Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Used for determining nucleic acid concentrations |
NASBA kit | Life Sciences Advanced Technologies | NWK-1 | Isothermal amplification reaction components |
Nuclease free H20 | invitrogen | 10977015 | Added to reaction mixes |
PAGE electrophoresis system | Biorad | 1658001FC | Used to cast and run polyacrylamide gels |
pCOLADuet-LacZ DNA | Addgene | 75006 | https://www.addgene.org/75006/ |
Phusion polymerase/reactioin buffer | New England Biolabs | M0530L | Used for PCRs |
Plate reader | BioTek | BioTek NEO2 | Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2 |
Primers | Integrated DNA Technologies | Custom oligo synthesis | |
Q5 polymerase/reaction buffer | New England Biolabs | M0491L | Used for PCRs |
Qiagen PCR Puriifcation Kit | QIAGEN | 27106 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | 2X RNA loading dye |
RNA Purification Kit | QIAGEN | EN0521 | QIAamp Viral RNA extraction kit |
RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | Used to prevent contamination of RNases A, B, and C |
RT-qPCR kit | QIAGEN | 208352 | QuantiNova Probe RT-PCR Kit |
SYBR Gold | Invitrogen S11494 | S11494 | PAGE gel stain for nucleic acids |
TAE Buffer | BioShop Canada | TAE222.4 | Gel electrophoresis buffer |
Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | Used for temperature cycling and incubating reactions |
Whatman 42 filter paper | GE Healthcare | 1442-042 | Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics |