आगे बढ़ने के लिए, विकास शंकु को बाहरी वातावरण के खिलाफ कर्षण बलों को लागू करना चाहिए। कर्षण बलों की पीढ़ी एक्टिन गतिशीलता और क्लच युग्मन पर निर्भर करती है। वर्तमान अध्ययन विकास शंकु अग्रिम के लिए एक्टिन गतिशीलता, क्लच युग्मन और कर्षण बलों का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करता है।
कार्यात्मक नेटवर्क स्थापित करने के लिए, न्यूरॉन्स को अपने उपयुक्त गंतव्यों पर माइग्रेट करना चाहिए और फिर अक्षतंतुओं को अपने लक्ष्य कोशिकाओं की ओर बढ़ाना चाहिए। ये प्रक्रियाएं विकास शंकुओं की प्रगति पर निर्भर करती हैं जो न्यूराइट्स की युक्तियों पर स्थित हैं। अक्षीय विकास शंकु अपने स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट को संवेदन करके ड्राइविंग बलों को उत्पन्न करते हैं और साइटोस्केलेटल गतिशीलता और एक्टिन-आसंजन युग्मन (क्लच युग्मन) को मॉड्युलेट करते हैं। दशकों के शोध ने न्यूरोनल माइग्रेशन और चेताक्षीय मार्गदर्शन को विनियमित करने के लिए मार्गदर्शन अणुओं, उनके रिसेप्टर्स और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड की पहचान की है; हालांकि, विकास शंकु अग्रिम और नेविगेशन ड्राइव करने के लिए बलों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक आणविक मशीनरी अभी स्पष्ट होने लगी हैं। न्यूरोनल विकास शंकु के अग्रणी किनारे पर, एक्टिन फिलामेंट्स प्रतिगामी प्रवाह से गुजरते हैं, जो एक्टिन पोलीमराइजेशन और एक्टोमायोसिन संकुचन द्वारा संचालित होता है। एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाला सब्सट्रेट के बीच एक क्लच युग्मन विकास शंकु अग्रिम के लिए कर्षण बलों को उत्पन्न करता है। वर्तमान अध्ययन एकल धब्बेदार इमेजिंग द्वारा एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। महत्वपूर्ण रूप से, जब एक एफ-एक्टिन मार्कर लाइफएक्ट के साथ संयुक्त किया जाता है, तो यह तकनीक 1) एफ-एक्टिन पोलीमराइजेशन दर और 2) एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाले सब्सट्रेट के बीच क्लच युग्मन दक्षता को निर्धारित कर सकती है। दोनों विकास शंकु अग्रिम और नेविगेशन के लिए बलों को उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण चर हैं। इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो 3) विकास शंकु द्वारा उत्पन्न कर्षण बल को निर्धारित कर सकता है। इस प्रकार, एकल धब्बेदार इमेजिंग और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के विश्लेषण को युग्मन करके, जांचकर्ता विकास शंकु अग्रिम और नेविगेशन के अंतर्निहित आणविक यांत्रिकी की निगरानी कर सकते हैं।
विकासशील कशेरुकी मस्तिष्क में, न्यूरॉन्स कार्यात्मक न्यूरोनल नेटवर्क 1,2,3 स्थापित करने के लिए उचित सिनैप्टिक भागीदारों की ओर विस्तृत रूप से संगठित प्रवास और परियोजना अक्षतंतुओं से गुजरते हैं। विकास शंकु, जो संवेदी और गतिशील संरचनाएं हैं जो न्यूराइट्स की नोक पर स्थित हैं, न्यूरोनल माइग्रेशन और अक्षतंतु आउटग्रोथ 3,4,5 की गति और दिशा निर्धारित करते हैं। चूंकि न्यूरॉन्स कसकर पैक किए गए वातावरण से घिरे होते हैं, इसलिए विकास शंकु को आगे बढ़ने के लिए अपने पर्यावरण के खिलाफ बलों को लागू करना चाहिए6,7। न्यूरोनल माइग्रेशन और अक्षीय मार्गदर्शन के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, विकास शंकु अग्रिम के लिए आणविक यांत्रिकी का विश्लेषण आवश्यक है।
दशकों के विश्लेषण से पता चला है कि विकास शंकु अग्रिम को चलाने के लिए कर्षण बल ‘क्लच’ तंत्र द्वारा उत्पन्न होता है; इस तंत्र को न केवल क्षैतिज विकास शंकु में बल्कि न्यूरॉन्स 8,9,10,11,12 को स्थानांतरित करने की अग्रणी प्रक्रिया विकास शंकु में भी कार्य करने के लिए सोचा जाता है। अर्थात्, विकास शंकु में एक्टिन फिलामेंट्स (एफ-एक्टिन्स) अग्रणी किनारे पर पॉलिमराइज़ करते हैं और समीपस्थ रूप से डीपोलीमराइज़ करते हैं, अग्रणी-किनारे झिल्ली को बाहर निकालते हैं13,14,15। परिणामी बल, एक्टोमायोसिन संकुचन के साथ संयोजन के रूप में, प्रतिगामी प्रवाह 7,11,16,17,18,19,20,21 नामक एफ-एक्टिन के पीछे की ओर आंदोलन को प्रेरित करता है। क्लच- और सेल आसंजन अणु एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाले सब्सट्रेट के बीच यांत्रिक युग्मन की मध्यस्थता करते हैं और सब्सट्रेट पर एफ-एक्टिन प्रवाह के बल को प्रसारित करते हैं, जिससे विकास शंकु अग्रिम 7,8,9,11,12,22 के लिए कर्षण बल उत्पन्न होता है। . समवर्ती रूप से, एक्टिन-सब्सट्रेट युग्मन एफ-एक्टिन प्रवाह वेग को कम कर देता है और अग्रणी-किनारे झिल्ली 9,10 को बाहर निकालने के लिए बल में एक्टिन पोलीमराइजेशन को परिवर्तित करता है।
अक्षीय विकास शंकु स्थानीय रासायनिक संकेतों को समझते हैं और उन्हें विकास शंकु नेविगेशन 3,23,24,25 के लिए एक दिशात्मक ड्राइविंग बल में ट्रांसड्यूस करते हैं। उदाहरण के लिए, एक अक्षतंतु मार्गदर्शन अणु नेट्रिन -1 कोलोरेक्टल कैंसर (डीसीसी) में हटाए गए अपने रिसेप्टर को उत्तेजित करता है, और Rho guanosine ट्राइफॉस्फेट (GTP) – बाध्यकारी प्रोटीन सेल डिवीजन नियंत्रण प्रोटीन 42 (Cdc42) और रास से संबंधित C3 बोटुलिनम विष सब्सट्रेट 1 (Rac1), और उनके डाउनस्ट्रीम किनेज p21-सक्रिय किनेज 1 (Pak1)26 को सक्रिय करता है। Cdc42 और Rac1 को बढ़ावा देते हैं 1) एक्टिन पोलीमराइजेशन, और Pak1 फॉस्फोराइलेट्स एक क्लच अणु shootin122,26. शूटिन 1 एक एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन कोर्टेक्टिन 27 के माध्यम से एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह के साथ बातचीत करता है। शूटिन 1 भी एल 1 सेल आसंजन अणु (एल 1-सीएएम) 20,24 के साथ बातचीत करता है। शूटिन 1 फॉस्फोराइलेशन cortactin और L1-CAM के लिए बाध्यकारी संबंधों को बढ़ाता है, और shootin1-मध्यस्थता 2) क्लच युग्मन 24,27 को बढ़ाता है। विकास शंकु के भीतर, एक्टिन पोलीमराइजेशन और क्लच युग्मन के विषम सक्रियण 3) नेट्रिन -1 स्रोत के पक्ष में कर्षण बल में वृद्धि करते हैं, जिससे विकास शंकु मोड़ के लिए दिशात्मक ड्राइविंग बल उत्पन्न होता है (चित्रा 1)24। न्यूरोनल माइग्रेशन और अक्षतंतु मार्गदर्शन के संबंध में पिछले कुछ दशकों में गहन शोध ने मार्गदर्शन अणुओं, उनके रिसेप्टर्स और संबंधित डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड 2,10,28,29,30 की समझ को बढ़ाया है। हालांकि, विकास शंकु अग्रिम के लिए बलों को उत्पन्न करने के लिए आणविक मशीनरी अभी स्पष्ट होने लगी हैं; यह mechanobiological विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल के सीमित उपयोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.
वर्तमान अध्ययन एकल धब्बेदार इमेजिंग 16,18 द्वारा एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और कुल हस्तक्षेप प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी 25,31,32,33,34,35,36,37,38 का उपयोग करके एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी बड़े पैमाने पर की गई है . वर्तमान अध्ययन में प्रोटोकॉल, हालांकि, एक मानक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है और इस प्रकार आसानी से अपनाने योग्य है11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42। जब Lifeact43 द्वारा F-actin लेबलिंग के साथ संयुक्त, एकल धब्बेदार इमेजिंग एक्टिन पोलीमराइजेशन दर और F-actin प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाला सब्सट्रेट 39,42 के बीच क्लच युग्मन दक्षता के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है। वर्तमान अध्ययन आगे एक फ्लोरोसेंट मनका-एम्बेडेड पॉलीएक्रिलामाइड (पीएए) जेल 11,22,23,24,27,39,41,42,44 का उपयोग करके कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह विधि बल-प्रेरित मनका आंदोलनों 44,45 की निगरानी करके विकास शंकु के तहत कर्षण बल का पता लगाती है और मात्रा निर्धारित करती है। एक ओपन-सोर्स कर्षण बल विश्लेषण कोड प्रदान किया जाता है, और विकास शंकु माइग्रेशन के दौरान कर्षण बल को परिमाणित करने की विधि को विस्तार से समझाया गया है। एकल धब्बेदार इमेजिंग और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी की सहायता से, विकास शंकु प्रवास और नेविगेशन के अंतर्निहित आणविक यांत्रिकी को समझने की सुविधा होगी। ये तकनीकें डेंड्राइटिक स्पाइन इज़ाफ़ा के अंतर्निहित आणविक यांत्रिकी का विश्लेषण करने के लिए भी लागू होती हैं, जिसे सीखने और मेमोरी 42 में महत्वपूर्ण माना जाता है।
इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल सभी प्रयोगशालाओं, संस्थानों और विश्वविद्यालयों में नियमित रूप से पाए जाने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्रियों और माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग करते हैं। इसलिए, जांचकर्ता आसानी से अपने अध्ययन में वर्तमान एकल धब्बेदार इमेजिंग और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी को अपना सकते हैं।
धब्बेदार इमेजिंग एक्टिन पोलीमराइजेशन और क्लच युग्मन का विश्लेषण कर सकती है। इसके अलावा, धब्बेदार इमेजिंग क्लच अणुओं जैसे कि शूटिन 1 और कोर्टेक्टिन के प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी कर सकती है, जो एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह के साथ बातचीत करती है। एक TIRF माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सेल आसंजन अणु L1-CAM के प्रतिगामी प्रवाह की भी निगरानी की जा सकती है23,41; L1-CAM पकड़ और पर्ची व्यवहार से गुजरता है जो क्लच युग्मन दक्षता 23,41 को दर्शाता है। यद्यपि वर्तमान अध्ययन धब्बेदार इमेजिंग के लिए टीएमआर-हैलोटैग प्रणाली को नियोजित करता है, अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जैसे कि ईजीएफपी और मोनोमेरिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, विश्लेषण में भी उपलब्ध हैं16,18,20,23,24,27,39। एक्टिन धब्बेदारों की कल्पना करने के लिए आवश्यक फ्लोरोसेंट एक्टिन का एक कम अभिव्यक्ति स्तर और न्यूनतम क्षेत्र की रोशनी (चित्रा 2) हैं। इस प्रोटोकॉल में, Lifeact और HaloTag-actin संकेतों को क्रमिक रूप से प्राप्त किया जाता है। क्योंकि एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह अपेक्षाकृत धीमा है (4.5 ± 0.1 μm / min)24, एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और एक्टिन पोलीमराइजेशन का विश्लेषण विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों (~ 1 s अंतराल) के अनुक्रमिक छवि अधिग्रहण से अप्रभावित है। Lifeact एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया एफ एक्टिन मार्कर है, लेकिन actin बाध्यकारी प्रोटीन 47 के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं. आगे के महत्व के, Lifeact actin गतिशीलता को बदल सकते हैं, जिससे F-actin संरचनाओं और सेल आकृति विज्ञान 47,48,49 को प्रभावित किया जा सकता है।
कर्षण बल माइक्रोस्कोपी विकास शंकु अग्रिम ड्राइव करने के लिए बलों का पता लगा सकते हैं। एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के भीतर न्यूरॉन्स को माउंट करके, जांचकर्ता अर्ध-3 डी वातावरण में उत्पन्न बलों का विश्लेषण भी कर सकते हैं। उच्च आवर्धन इमेजिंग कर्षण बल के सटीक परिमाणीकरण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि विकास शंकु कमजोर कर्षण बल उत्पन्न करते हैं7। यद्यपि नैनोपिलर या तनाव-संवेदनशील बायोसेंसर के साथ अन्य तरीकों का उपयोग कर्षण बल 50,51 को मापने के लिए भी किया जाता है, पीएए जेल-आधारित विधि अत्यधिक अनुकूलनीय है और एक्रिलामाइड और बीआईएस-एक्रिलामाइड 41,44,52 की सांद्रता को बदलकर सब्सट्रेट कठोरता के समायोजन की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में, पीएए जेल को 3.75% एक्रिलामाइड और 0.03% बिस-एक्रिलामाइड की अंतिम एकाग्रता पर तैयार किया जाता है; यंग का मापांक ~ 270 Pa22 है और यह कठोरता मस्तिष्क के ऊतकों (100-10,000 Pa) 53,54,55 की सीमा के भीतर है। पीएए जेल (~ 100 μm) की मोटाई के कारण, यह विधि माइक्रोस्कोपी के दौरान उच्च आवर्धन लेंस के उपयोग को सीमित करती है। उच्च आवर्धन छवियों को प्राप्त करने के लिए, जांचकर्ताओं को लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में ज़ूम फ़ंक्शन का उपयोग करना चाहिए।
अंत में, वर्तमान धब्बेदार इमेजिंग और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी बल पीढ़ियों में प्रमुख घटनाओं के मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हैं। यह जानकारी उन तंत्रों की समझ में सुधार के लिए अमूल्य होगी जो विकास शंकु प्रगति और नेविगेशन को रेखांकित करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को एएमईडी द्वारा अनुदान संख्या 21gm0810011h0005 (N.I. और Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) और JSPS अनुदान-इन-एड फॉर अर्ली-कैरियर वैज्ञानिकों (JP19K16258, T.M), ओसाका मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन फॉर लाइलाज डिजीज (T.M.), और NAIST अगली पीढ़ी के अंतःविषय अनुसंधान परियोजना (NAIST) के तहत भाग में समर्थित किया गया था।
0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
Papain | Nacalai | 26036-34 | |
Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |