O presente protocolo fornece informações instrucionais para o uso do tromfo de tabaco Manduca sexta na pesquisa canabinoide. O método descrito aqui inclui todos os suprimentos e protocolos necessários para monitorar alterações fisiológicas e comportamentais do modelo de insetos em resposta ao tratamento do canabidiol (CBD).
Com maior atenção aos canabinóides na medicina, vários organismos modelo de mamíferos têm sido usados para elucidar suas funções farmacêuticas desconhecidas. No entanto, muitas dificuldades permanecem na pesquisa de mamíferos, o que requer o desenvolvimento de organismos modelo não-mamíferos para a pesquisa canabinoide. Os autores sugerem o chifre de tabaco Manduca sexta como um novo sistema de modelo de insetos. Este protocolo fornece informações sobre a preparação da dieta artificial com quantidades variadas de canabidiol (CBD), criação de um ambiente de cultivo e monitoramento de suas mudanças fisiológicas e comportamentais em resposta ao tratamento cbd. Resumidamente, ao receber ovos de vermes, os ovos foram permitidos de 1 a 3 dias a 25 °C em um ciclo claro-escuro de 12:12 para eclodir antes de serem distribuídos aleatoriamente no controle (dieta artificial à base de germes de trigo; AD), veículo (AD + 0,1% óleo de triglicerídeo de cadeia média; Óleo mct) e grupos de tratamento (AD + 0,1% MCT + 1 mM ou 2 mM de CBD). Uma vez que a mídia foi preparada, 1ª larva instar foram colocadas individualmente em um tubo de ensaio de 50 mL com um espeto de madeira, e então o tubo de ensaio foi coberto com um pano de queijo. As medições foram tomadas em intervalos de dois dias para respostas fisiológicas e comportamentais à administração do CBD. Este simples procedimento de cultivo permite que os pesquisadores testem grandes espécimes em um determinado experimento. Além disso, os ciclos de vida relativamente curtos permitem que os pesquisadores estudem o impacto dos tratamentos canabinoides ao longo de várias gerações de uma população homogênea, permitindo que os dados apoiem um design experimental em organismos de modelos de mamíferos mais altos.
Nos últimos anos, a atenção pública tem sido centrada nos canabinoides devido ao seu potencial terapêutico, incluindo o tratamento da epilepsia1, doença de Parkinson2, esclerose múltipla3 e várias formas de câncer4,5,6 com canabidiol (CBD). Como a Cannabis é legalizada como uma mercadoria agrícola na Lei de Melhoria Agrícola de 2018, a Lei Pública 115-334 (a Lei da Fazenda 2018), a Cannabis e seus derivados canabinóides nas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica aumentaram exponencialmente. Além disso, isolados de grau clínico de canabinoides únicos e misturas canabinoides foram testados com sucesso em indivíduos humanos7, linhas celulares5,8 e diversos sistemas de modelo animal9,10.
Um ensaio clínico seria ideal para validar a eficácia e os efeitos adversos dos canabinoides em uma doença específica. No entanto, existem inúmeros desafios em ensaios clínicos, incluindo aprovação ética/IRB, recrutamento e retenção dos sujeitos11. Para superar esses obstáculos, várias linhas de células humanas foram usadas porque as linhas celulares derivadas do homem são econômicas, fáceis de manusear, podem contornar as questões éticas e fornecer resultados consistentes e reprodutíveis, pois as linhas celulares são uma “população pura de células que não têm contaminação cruzada de outras células e produtos químicos”12.
Alves et al. (2021)13 testaram CBD de forma dependente de dose nos trophoblastos placentários, que são células especializadas da placenta que desempenham um papel essencial na implantação e interação com o útero materno deciditizado14. Seus resultados mostraram que o CBD causou perda de viabilidade celular, interrupção da progressão do ciclo celular e indução da apoptose. Essas observações demonstram os potenciais impactos negativos do uso da Cannabis por mulheres grávidas13. Da mesma forma, uma série de linhas celulares também foram utilizadas para examinar os efeitos farmacológicos do CBD em doenças humanas, em particular, várias formas de câncer. Os estudos in vitro demonstraram com sucesso efeitos anticu câncer em células cancerígenas pancreáticas15, mama8 e colorretal16. No entanto, embora esteja amplamente disponível e fácil de manusear, linhas celulares específicas como HeLa, HEK293 são propensas a alterações genéticas e fenotípicas devido a alterações em suas condições de crescimento ou manuseio17.
Na pesquisa da Cannabis, vários sistemas de modelos animais, que vão desde pequenos animais como mouse18, cobaia-pig19 e coelho19 até animais de grande porte como canino20, leitão21, macaco22, cavalo23, têm sido usados para explorar efeitos terapêuticos desconhecidos. Os camundongos têm sido o sistema de modelo animal mais preferido para a pesquisa canabinoide devido à sua semelhança anatômica, fisiológica e genética com os humanos24. Mais significativamente, os camundongos têm receptores CB1/2 em seu sistema nervoso, que estão presentes em humanos. Eles também têm um ciclo de vida mais curto do que os seres humanos, com manutenção mais fácil e recursos genéticos abundantes, tornando muito mais fácil monitorar os efeitos dos canabinoides durante todo um ciclo de vida. O sistema mamífero é amplamente utilizado e demonstrou com sucesso que o CBD alivia distúrbios convulsivos1, transtorno de estresse pós-traumático9, úlceras bucais25 e sintomas semelhantes a demência10. O modelo de camundongos também possibilitou um estudo de interação social de indivíduos dentro de uma comunidade que é extremamente difícil em animais de grande porte e humanos26.
Apesar de todas as vantagens do sistema de modelo animal, ele ainda é caro e requer cuidados intensivos durante a administração de medicamentos e coleta de dados. Além disso, há escrutínio do uso de camundongos em pesquisas devido à irreprodutividade e má recapitulação das condições humanas devido a limitações no design experimental e rigor27.
Com a crescente demanda por estudos médicos/pré-clínicos de canabinóides, é necessário um sistema modelo não-mamífero. Modelos invertebrados tradicionalmente conferiam benefícios distintos sobre modelos de vertebrados. Os benefícios significativos incluem a facilidade e o baixo custo de criar muitos espécimes e permitir que os pesquisadores monitorem múltiplas gerações de populações geneticamente homogêneas28. Um estudo recente comprovou que a mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, é um sistema eficaz de modelo de insetos para investigar funções farmacológicas de canabinóides na modulação dos comportamentos alimentares29. Entre os sistemas de modelos de insetos, os autores se concentraram na minhoca do tabaco, manduca sexta, também conhecida como mariposa de esfinge carolina ou mariposa falcão, como um novo sistema modelo de insetos para pesquisa canabinoide.
Manduca sexta pertence à família de Sphingidae. O inseto é a praga vegetal mais comum no sul dos Estados Unidos, onde se alimentam de plantas solanáceas. O modelo de insetos tem uma longa história em pesquisas em estudos de fisiologia de insetos, bioquímica, neurobiologia e interação medicamentosa. O portfólio de pesquisa de Manduca sexta inclui uma sequência de genomas, permitindo uma compreensão em nível molecular dos processos celulares essenciais30. Outro benefício crucial deste sistema modelo é o seu grande tamanho, atingindo mais de 100 mm de comprimento e 10 g de peso nos 18-25 dias de desenvolvimento larval. O tamanho grande permite que os pesquisadores monitorem facilmente as mudanças morfológicas e comportamentais em tempo real em resposta ao tratamento do CBD. Além disso, devido ao tamanho, as respostas eletrofisiológicas foram examinadas com o sistema nervoso abdominal, incluindo gânglios dissecados das larvas sem configurações de microscópio de alta resolução. O recurso único permite que os pesquisadores investiguem prontamente respostas agudas e de longo prazo aos canabinoides administrados.
Apesar de tal versatilidade, M. sexta só recentemente foi explorado por sua adequação como modelo experimental para estudos de Cannabis e canabinoides. Em 2019, os autores utilizaram pela primeira vez o sistema modelo de insetos para abordar a hipótese de que a Cannabis evoluiu para produzir canabidiol para se proteger de herbívoros de insetos30,31. O resultado mostrou claramente que as plantas exploraram o CBD como um impedimento alimentar e inibiram o crescimento da lagarta m. sexta inseto de pragas, além de causar aumento da mortalidade31. O estudo também demonstrou os efeitos de resgate do CBD para larvas de etanol intoxicados, identificando o potencial efeito veicular do etanol como portador do CBD. Como mostrado, o sistema modelo de insetos investigou efetivamente os efeitos terapêuticos dos canabinóides dentro de 3-4 semanas com menos mão-de-obra e custos do que outros sistemas animais. Embora o modelo de insetos carece de receptores canabinoides (ou seja, sem receptores CB1/2), o sistema modelo fornece uma ferramenta valiosa para entender os papéis farmacológicos dos canabinóides através de uma maneira canabinoide independente do receptor.
Os autores deste estudo já trabalharam com a minhoca de tabaco como um sistema modelo para pesquisas canabinoides31. Após cuidadosa consideração dos benefícios e riscos do uso de M. sexta, fornecemos um método que envolve o cuidado adequado e a preparação da dieta para ensaios pré-clínicos que permitem oportunidades para futuros usos laboratoriais pré-clínicos.
O estudo de alimentação demonstrou que altas doses de CBD (2 mM) inibiram o crescimento do inseto e aumentaram a mortalidade31. O modelo de insetos também mostrou sensibilidade ao etanol; no entanto, o CBD efetivamente desintoxicou a toxicidade do etanol, aumentando sua taxa de sobrevivência, consumo de dieta e comportamentos de busca de alimentos para níveis semelhantes ao grupo controle (Figura 3A,B)31. O sistema de mode…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Pesquisa da Cannabis da Universidade do Estado do Colorado-Pueblo e do Ministério da Ciência e TIC (2021-DD-UP-0379) e pela cidade de Chuncheon (CânhamO P&D e industrialização, 2020-2021).
Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |