Modelado de señalización Wnt no canónica paracrina in vitro
Summary
El presente estudio describe un método altamente reproducible y manejable para estudiar eventos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro. Este protocolo se aplicó para evaluar el impacto de la señalización paracrina Wnt5a en células murinas de la cresta neural y mioblastos.
Abstract
La señalización Wnt no canónica regula la organización intracelular del filamento de actina y la migración polarizada de las células progenitoras durante la embriogénesis. Este proceso requiere interacciones paracrinas complejas y coordinadas entre las células emisoras y receptoras de señales. Dado que estas interacciones pueden ocurrir entre varios tipos de células de diferentes linajes, la evaluación in vivo de defectos específicos de células puede ser un desafío. El presente estudio describe un método altamente reproducible para evaluar la señalización paracrina no canónica de Wnt in vitro. Este protocolo fue diseñado con la capacidad de (1) realizar evaluaciones funcionales y moleculares de la señalización Wnt no canónica entre dos tipos de células de interés; (2) diseccionar el papel de las moléculas de envío de señales versus moléculas receptoras de señales en la vía de señalización Wnt no canónica; y (3) realizar experimentos fenotípicos de rescate con enfoques moleculares o farmacológicos estándar.
Este protocolo se utilizó para evaluar la señalización Wnt no canónica mediada por células de la cresta neural (NCC) en mioblastos. La presencia de NCC se asocia con un mayor número de filopodios citoplasmáticos positivos para faloidina y lamellipodia en mioblastos y una mejor migración de mioblastos en un ensayo de cicatrización de heridas. El eje Wnt5a-ROR2 se identificó como una vía de señalización Wnt no canónica crucial entre NCC y progenitores de cardiomioblastos del segundo campo cardíaco (SHF). En conclusión, este es un protocolo altamente manejable para estudiar los mecanismos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro.
Introduction
La señalización Wnt no canónica es una vía conservada evolutivamente que regula la organización del filamento celular y la migración direccional. Esta vía ha sido implicada en múltiples procesos biológicos, incluyendo la morfogénesis tisular embrionaria 1,2,3, la angiogénesis linfática y vascular 4,5,6,7, y el crecimiento y metástasis del cáncer 8,9,10 . A nivel celular, la señalización Wnt no canónica se lleva a cabo a través de interacciones paracrinas coordinadas entre las células emisoras y receptoras de señales. Estas interacciones ocurren frecuentemente entre células de diferentes linajes o tipos e involucran una red molecular diversa que incluye hasta 19 ligandos y múltiples receptores, correceptores y efectores de transducción de señales aguas abajo11. Para complicar aún más este proceso de señalización, estudios previos han demostrado que las combinaciones ligando-receptor pueden variar de manera dependiente del contexto y del tejido 12,13, y que los mismos ligandos fuente que impulsan la señalización Wnt no canónica en las células receptoras de señales pueden ser producidos por múltiples tipos de células emisoras de señales 14,15 . Dada la complejidad celular y molecular asociada con la señalización Wnt no canónica, la capacidad de estudiar mecanismos individuales y clínicamente relevantes in vivo ha sido limitada.
Se han hecho intentos para estudiar la señalización Wnt no canónica utilizando técnicas de cultivo celular in vitro. Por ejemplo, los ensayos de cicatrización de heridas realizados en monocapas celulares se han utilizado para evaluar funcionalmente la migración direccional celular 4,16,17,18,19. Se han utilizado técnicas de inmunotinción para realizar análisis espaciales de la expresión de proteínas de superficie para evaluar cambios no canónicos inducidos por Wnt en morfología celular 7,10, arquitectura y polarización asimétrica18,19,20. Aunque estos enfoques han proporcionado herramientas importantes para caracterizar fenotipos relacionados con Wnt en células receptoras de señales, la falta de componentes de envío de señales en estos protocolos limita su capacidad para modelar con precisión los mecanismos de señalización paracrina observados in vivo. Como resultado, sigue existiendo una necesidad crítica de desarrollar sistemas in vitro que permitan una evaluación robusta y reproducible de las interacciones de señalización paracrina entre las células emisoras y receptoras de señales de la vía Wnt no canónica, particularmente aquellas de diferentes tipos celulares.
Con este fin, el objetivo principal de este estudio fue establecer un protocolo para modelar interacciones de señalización Wnt paracrinas no canónicas in vitro. Desarrollamos un sistema de cocultivo sin contacto que recapitula los componentes de envío y recepción de señales de estas interacciones y permite el uso de enfoques moleculares, genéticos o farmacológicos estándar para estudiar de forma independiente mecanismos específicos de ligando-receptor en la vía Wnt no canónica. Los mecanismos de señalización Wnt mediada por NCC se examinaron en mioblastos utilizando líneas celulares murinas establecidas. Como prueba de principio, este modelo se utilizó para corroborar los hallazgos de estudios previos in vivo en ratones que implican el eje Wnt5a-ROR2 como una vía de señalización Wnt no canónica relevante entre NCCs 21 y progenitores de cardiomioblastos SHF 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vía de señalización no canónica Wnt/polaridad celular plana (PCP) es una vía de señalización celular de importancia crítica que ha sido implicada en múltiples procesos de desarrollo 24,25 y de enfermedad24,26. Durante el desarrollo embrionario, la señalización Wnt no canónica implica una red expansiva de señales moleculares de células emisoras de señales que finalmente inducen c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por los premios NIH F30HL154324 a O.T. y K08HL121191 y R03HL154301 a S.R.K. Los autores desean reconocer que el esquema de la Figura 1 de este manuscrito fue creado con biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
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