रूट एक्सूडेट्स में Rhizobacterial Chemoattractants की तेजी से पहचान के लिए एक बेहतर Chemotaxis परख
Summary
यहाँ, हम एक बेहतर chemotaxis परख प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य पारंपरिक बैक्टीरियल केमोटैक्सिस विधियों के चरणों और लागतों को कम करना और पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन को समझने के लिए एक मूल्यवान संसाधन के रूप में सेवा करना है।
Abstract
Chemotaxis पहचान अनुसंधान और rhizosphere विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया के आवेदन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. हमने chemoattractants की जल्दी से पहचान करने के लिए एक सीधी विधि स्थापित की जो सरल चरणों के माध्यम से बाँझ ग्लास स्लाइड पर राइजोस्फीयर विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया के कीमोटैक्टिक आंदोलन को प्रेरित कर सकती है। बैक्टीरिया समाधान (OD600 = 0.5) और बाँझ chemoattractant जलीय समाधान 1 सेमी के अंतराल पर कांच की स्लाइड पर dropwise जोड़ा गया था। एक इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग कीमोएट्रैक्टेंट जलीय घोल को जीवाणु समाधान से जोड़ने के लिए किया गया था। स्लाइड को साफ बेंच पर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया था। अंत में, chemoattractant जलीय समाधान जीवाणु गिनती और सूक्ष्म अवलोकन के लिए एकत्र किया गया था। इस अध्ययन में, प्रयोगात्मक परिणामों की कई तुलनाओं के माध्यम से, विधि ने पारंपरिक बैक्टीरियल केमोटैक्सिस विधियों की कई कमियों को पार किया। विधि ने प्लेट गिनती की त्रुटि को कम कर दिया और प्रयोगात्मक चक्र को छोटा कर दिया। chemoattractant पदार्थों की पहचान के लिए, यह नई विधि पारंपरिक विधि की तुलना में 2-3 दिनों की बचत कर सकती है। इसके अतिरिक्त, यह विधि किसी भी शोधकर्ता को 1-2 दिनों के भीतर एक जीवाणु केमोटैक्सिस प्रयोग को व्यवस्थित रूप से पूरा करने की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल को पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन को समझने के लिए एक मूल्यवान संसाधन माना जा सकता है।
Introduction
Chemotaxis जड़ों पर पौधे के विकास को बढ़ावा देने वाले राइजोबैक्टीरियल (PGPR) के उपनिवेशीकरण के लिए और पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है1। पौधों की जड़ में कम आणविक भार यौगिकों (chemoattractants) का एक वर्ग rhizosphere2 के लिए PGPR के chemotactic आंदोलन को प्रेरित करता है। मैलिक एसिड, साइट्रिक एसिड, और जड़ में अन्य घटकों को उत्तेजित करता है बेसिलस उपभेदों 3 के chemotaxis उत्तेजित। उदाहरण के लिए, ग्लूकोज, साइट्रिक एसिड, और मक्का की जड़ में फ्यूमेरिक एसिड एक्सूडेट्स बैक्टीरिया को जड़ की सतह पर भर्ती करते हैं4। डी-गैलेक्टोज, जो रूट एक्सूडेट्स से व्युत्पन्न होता है, बैसिलस वेलेज़ेन्सिस एसक्यूआर 95 के केमोटैक्सिस को प्रेरित करता है। कार्बनिक एसिड, fumarate, मैलिक एसिड, और succinate सहित, chemotaxis और Cajanus cajan में विभिन्न PGPR के उपनिवेशीकरण को प्रभावित – Zea mays intercropping system6. चावल की जड़ में Oleanolic एसिड exudates, तनाव FP357 के लिए एक chemoattractant के रूप में कार्य करता है। अन्य पौधे exudates (हिस्टिडीन, arginine, और aspartate सहित) बैक्टीरिया की chemotactic प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं8. प्लांट एक्सुडेट्स बैक्टीरिया के आंदोलन को निर्देशित करने के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करते हैं, जो राइजोस्फीयर उपनिवेशीकरण के दौरान पहला कदम है। PGPR द्वारा संयंत्र उपनिवेशीकरण भारी प्रासंगिकता की एक प्रक्रिया है, क्योंकि PGPR संयंत्र मेजबान के लिए फायदेमंद हैं।
बैक्टीरियल कीमोटैक्सिस का विश्लेषण करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है। तैराकी प्लेट विधि पहले वर्णित तरीकों में से एक है9। इस विधि में, प्लेटों को एक अर्ध-ठोस माध्यम से बनाया गया था। एक कीमोटैक्टिक बफर जिसमें आगर (1.0%, w / v) होता है, प्लेट में जोड़ा गया था। बफर को गर्म किया जाता है, और फिर chemoattractant के साथ मिश्रित किया जाता है। फिर, बैक्टीरिया निलंबन के 8 μL को प्लेट के बीच में ड्रॉपवाइज जोड़ा गया था और प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखा गया था। प्लेट को नियमित रूप से देखा और फोटो खिंचवाया गया। हालांकि, तैराकी प्लेट विधि का प्रयोगात्मक चक्र बहुत लंबा था। केशिका जैसी विधि 10 में, एक पिपेट टिप बैक्टीरियल निलंबन के 100 μL को पकड़ने के लिए एक कक्ष के रूप में कार्य करता है। 1 एमएल सिरिंज सुई का उपयोग केशिका के रूप में किया गया था। एक सिरिंज सुई जिसमें विभिन्न सांद्रता ग्रेडिएंट के साथ chemoattractants होते हैं, को 100 μL पिपेट टिप में डाला गया था। 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन के बाद, सिरिंज सुई को हटा दिया गया था, सामग्री को पतला किया गया था और माध्यम पर चढ़ाया गया था। सिरिंज में जीवाणु संचय को प्लेटों में कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) द्वारा दर्शाया गया था। हालांकि, केशिका जैसी विधि के लिए प्रतिकृति के भीतर प्रयोगात्मक त्रुटि बड़ी थी। एक अन्य विधि एक microfluidic SlipChip डिवाइस 11 का उपयोग किया. संक्षेप में, गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) समाधान को सभी चैनलों में इंजेक्ट किया गया था और एक वैक्यूम का उपयोग करके हटा दिया गया था। विभिन्न chemoattractants युक्त समाधान (केवल गुणात्मक पता लगाने के लिए 1 mM एकाग्रता), फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा और फॉस्फेट buffered खारा बफर (नकारात्मक नियंत्रण) में निलंबित जीवाणु कोशिकाओं को क्रमशः शीर्ष, मध्य और नीचे माइक्रोवेल में जोड़ा गया था। इनक्यूबेशन तब 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक अंधेरे वातावरण में किया गया था। इसके बाद माइक्रोवेल्स में बैक्टीरियल कोशिकाओं का पता चला। माइक्रोफ्लुइडिक स्लिपचिप डिवाइस, हालांकि, महंगा था। इसलिए, ऊपर वर्णित विधियों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान थे।
हम जटिल चरणों के बिना बाँझ कांच स्लाइड का उपयोग कर जड़ exudates में rhizobacterial chemoattractants की तेजी से पहचान के लिए एक बेहतर chemotaxis परख की स्थापना की. इस अध्ययन में, प्रयोगात्मक परिणामों की कई तुलनाओं के माध्यम से, विधि ने पारंपरिक बैक्टीरियल केमोटैक्सिस विधियों की कई कमियों को पार किया। विधि ने प्लेट गिनती की त्रुटि को कम कर दिया और प्रयोगात्मक चक्र को छोटा कर दिया। इसलिए, यदि एक chemoattractant पदार्थ की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो यह नई विधि 2-3 दिनों की बचत कर सकती है और प्रयोगात्मक सामग्रियों की लागत को कम कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
बढ़ते शोध से संकेत मिलता है कि पौधे-बैक्टीरिया इंटरैक्शन मुख्य रूप से राइजोस्फीयर में होते हैं और रूट एक्सूडेट्स 20,21,22,23,24 से प्रभावित होते हैं।<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 31870493), हेइलोंगजियांग, चीन (GA21B007) में प्रमुख अनुसंधान और विकास परियोजनाओं, और हेइलोंगजियांग प्रांत, चीन में विश्वविद्यालयों के बुनियादी अनुसंधान शुल्क (नंबर 135409103) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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