Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de ensaio de quimiotaxis melhorado. O objetivo deste protocolo é reduzir as etapas e custos dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana e servir como um recurso valioso para a compreensão das interações entre plantas e micróbios.
Abstract
A identificação de quimiotaxis é muito importante para a pesquisa e aplicação de bactérias promotoras do crescimento da rizofera. Estabelecemos um método simples para identificar rapidamente os quimioattractants que poderiam induzir o movimento quimotactic de bactérias promotoras do crescimento da rizosfera em lâminas de vidro estéreis através de passos simples. A solução bacteriana (OD600 = 0,5) e a solução aquosa quimioattractant estéril foram adicionadas dropwise no slide de vidro em um intervalo de 1 cm. Um loop inoculante foi usado para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução bacteriana. O slide foi mantido em temperatura ambiente por 20 minutos no banco limpo. Finalmente, foi coletada a solução aquosa quimioattractant para contagem bacteriana e observação microscópica. Neste estudo, por meio de múltiplas comparações de resultados experimentais, o método superou múltiplas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. O método reduziu o erro de contagem de placas e encurtou o ciclo experimental. Para a identificação de substâncias quimioattractant, este novo método pode economizar de 2 a 3 dias em comparação com o método tradicional. Além disso, este método permite que qualquer pesquisador complete sistematicamente um experimento de quimiotaxis bacteriana dentro de 1-2 dias. O protocolo pode ser considerado um recurso valioso para entender as interações entre plantas e micróbios.
Introduction
A quimiotaxis é importante para a colonização da rizobacteriana promotora do crescimento vegetal (PGPR) nas raízes e para a compreensão das interações entre plantas e micróbios1. Uma classe de compostos de baixo peso molecular (quimioattractants) em exudatas de raízes vegetais induzem o movimento quimotactic de PGPR à rizosfera2. Ácido malicílico, ácido cítrico e outros componentes nos exsudatos radiculares estimulam a quimotaxis das cepas de Bacillus3. Por exemplo, glicose, ácido cítrico e ácido fumarico na raiz do milho exsudam bactérias para a superfície raiz4. D-galactose, que é derivado de exudatas raiz, induz a quimiotaxis de Bacillus velezensis SQR95. Ácidos orgânicos, incluindo fumarato, ácido málico e succinato, influenciam a quimiotaxis e a colonização de vários PGPR no Cajan cajan – Zea mays intercropping system6. O ácido oleanolico em exsudates de raiz de arroz, atua como um quimioattractant para a cepa FP357. Outros exsudatos de plantas (incluindo histidina, arginina e aspartato) podem desempenhar um papel crucial na resposta quimotactica das bactérias8. Exsudatos vegetais funcionam como um sinal para direcionar o movimento das bactérias, que é o primeiro passo durante a colonização da rizofera. A colonização vegetal pela PGPR é um processo de enorme relevância, pois o PGPR é benéfico para o hospedeiro da planta.
Muitos métodos têm sido usados para analisar quimotaxis bacterianos. O método da placa de natação é um dos métodos descritos anteriormente9. Neste método, as placas foram feitas com um meio semisoólido. Um tampão quimotactic contendo ágar (1,0%, w/v) foi adicionado à placa. O tampão é aquecido e misturado com o quimioattractant. Em seguida, 8 μL de suspensão bacteriana foi adicionado dropwise ao meio da placa e a placa foi colocada em uma incubadora a 28 °C. A placa era regularmente observada e fotografada. No entanto, o ciclo experimental do método da placa de natação foi muito longo. No método capilar10, uma ponta de pipeta serve como câmara para segurar 100 μL de suspensão bacteriana. A agulha de seringa de 1 mL foi usada como capilar. Uma agulha de seringa contendo quimioattractants com diferentes gradientes de concentração foi inserida na ponta de pipeta de 100 μL. Após a incubação à temperatura ambiente por 3h, a agulha da seringa foi removida, o conteúdo foi diluído e banhado no meio. O acúmulo bacteriano na seringa foi representado por unidades formadoras de colônias (UFC) nas placas. No entanto, o erro experimental dentro das réplicas para o método capilar foi grande. Outro método utilizou um dispositivo SlipChip microfluidic11. Resumidamente, a solução de albumina de soro bovino (BSA) foi injetada em todos os canais e removida usando um vácuo. As soluções contendo diferentes quimioattractants (concentração de 1 mM apenas para detecção qualitativa), células bacterianas suspensas em soro fisiológico tampão salino tampão tampão tampão de fosfato (controle negativo) foram adicionadas às micro-habitas superior, média e inferior, respectivamente. A incubação foi então realizada em um ambiente escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. As células bacterianas foram então detectadas nos microwells. O dispositivo Microfluídico SlipChip, no entanto, era caro. Portanto, cada um dos métodos descritos acima tinha vantagens e desvantagens.
Estabelecemos um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em exsudatos radiculares usando lâminas de vidro estéreis sem etapas complicadas. Neste estudo, por meio de múltiplas comparações de resultados experimentais, o método superou múltiplas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. O método reduziu o erro de contagem de placas e encurtou o ciclo experimental. Portanto, se usado para identificar uma substância quimiofos, este novo método pode economizar de 2 a 3 dias e reduzir o custo de materiais experimentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pesquisas crescentes indicam que as interações entre plantas e bactérias ocorrem principalmente na rizosfera e são influenciadas por exsudates raiz20,21,22,23,24. Os exsudatos de raízes vegetais incluem uma variedade diversificada de metabólitos primários, incluindo ácidos fenólicos, ácidos orgânicos e aminoácidos, bem como compostos secundários …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Nos. 31870493), os Principais Projetos de Pesquisa e Desenvolvimento em Heilongjiang, China (GA21B007), e as Taxas Básicas de Pesquisa das Universidades da Província de Heilongjiang, China (No. 135409103).
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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