Un test di chemiotassi migliorato per la rapida identificazione dei chemioattrattivi rizobatterici negli essudati radicali
Summary
Qui, presentiamo un protocollo di test di chemiotassi migliorato. L’obiettivo di questo protocollo è quello di ridurre i passaggi e i costi dei metodi tradizionali di chemiotassi batterica e di servire come risorsa preziosa per la comprensione delle interazioni pianta-microbo.
Abstract
L’identificazione della chemiotassi è molto importante per la ricerca e l’applicazione dei batteri che promuovono la crescita della rizosfera. Abbiamo stabilito un metodo semplice per identificare rapidamente i chemioattrattivi che potrebbero indurre il movimento chemiotattico dei batteri che promuovono la crescita della rizosfera su vetrini sterili attraverso semplici passaggi. La soluzione batterica (OD600 = 0,5) e la soluzione acquosa chemioattrattante sterile sono state aggiunte gocciamente sul vetrino ad un intervallo di 1 cm. Un anello inoculante è stato utilizzato per collegare la soluzione acquosa chemioattrattante alla soluzione batterica. Lo scivolo è stato mantenuto a temperatura ambiente per 20 minuti sulla panca pulita. Infine, la soluzione acquosa chemioattrattante è stata raccolta per il conteggio batterico e l’osservazione microscopica. In questo studio, attraverso molteplici confronti di risultati sperimentali, il metodo ha superato molteplici carenze dei tradizionali metodi di chemiotassi batterica. Il metodo ha ridotto l’errore di conteggio delle piastre e abbreviato il ciclo sperimentale. Per l’identificazione delle sostanze chemioattrattatenti, questo nuovo metodo può far risparmiare 2-3 giorni rispetto al metodo tradizionale. Inoltre, questo metodo consente a qualsiasi ricercatore di completare sistematicamente un esperimento di chemiotassi batterica entro 1-2 giorni. Il protocollo può essere considerato una risorsa preziosa per comprendere le interazioni pianta-microbo.
Introduction
La chemiotassi è importante per la colonizzazione del rizobatterico che promuove la crescita delle piante (PGPR) sulle radici e per comprendere le interazioni pianta-microbo1. Una classe di composti a basso peso molecolare (chemioattrattivi) negli essudati delle radici delle piante induce il movimento chemiotattico della PGPR alla rizosfera2. L’acido malico, l’acido citrico e altri componenti negli essudati radicali stimolano la chemiotassi dei ceppi di Bacillus3. Ad esempio, il glucosio, l’acido citrico e l’acido fumarico negli essudati della radice di mais reclutano batteri sulla superficie della radice4. Il D-galattosio, che deriva dagli essudati radicali, induce la chemiotassi del Bacillus velezensis SQR95. Gli acidi organici, tra cui fumarato, acido malico e succinato, influenzano la chemiotassi e la colonizzazione di vari PGPR nel sistema di intercropping Cajanus cajan – Zea mays6. L’acido oleanolico negli essudati di radice di riso, agisce come chemioattrattante per il ceppo FP357. Altri essudati vegetali (tra cui istidina, arginina e aspartato) possono svolgere un ruolo cruciale nella risposta chemiotattica dei batteri8. Gli essudati vegetali funzionano come un segnale per dirigere il movimento dei batteri, che è il primo passo durante la colonizzazione della rizosfera. La colonizzazione delle piante da parte del PGPR è un processo di enorme rilevanza, in quanto i PGPR sono utili per l’ospite della pianta.
Molti metodi sono stati utilizzati per analizzare la chemiotassi batterica. Il metodo della piastra di nuoto è uno dei metodi descritti in precedenza9. In questo metodo, le piastre sono state realizzate con un mezzo semisolido. Un tampone chemiotattico contenente agar (1,0%, p/v) è stato aggiunto alla piastra. Il tampone viene riscaldato e quindi miscelato con il chemioattrattante. Quindi, 8 μL di sospensione batterica sono stati aggiunti a goccia al centro della piastra e la piastra è stata posta in un incubatore a 28 °C. La lastra è stata regolarmente osservata e fotografata. Tuttavia, il ciclo sperimentale del metodo della piastra di nuoto è stato molto lungo. Nel metodo simile a un capillare10, una punta di pipetta funge da camera per contenere 100 μL di sospensione batterica. 1 mL di ago per siringa è stato usato come capillare. Un ago per siringa contenente chemioattrattivi con diversi gradienti di concentrazione è stato inserito nella punta della pipetta da 100 μL. Dopo l’incubazione a temperatura ambiente per 3 ore, l’ago della siringa è stato rimosso, il contenuto è stato diluito e placcato sul mezzo. L’accumulo batterico nella siringa era rappresentato da unità formanti colonie (CFU) nelle piastre. Tuttavia, l’errore sperimentale all’interno delle repliche per il metodo simile a quello capillare era grande. Un altro metodo utilizzava un dispositivo SlipChip microfluidico11. In breve, la soluzione di albumina sierica bovina (BSA) è stata iniettata in tutti i canali e rimossa usando il vuoto. Le soluzioni contenenti diversi chemioattrattivi (concentrazione di 1 mM solo per il rilevamento qualitativo), cellule batteriche sospese in soluzione salina tamponata con fosfato e tampone fosfato tamponato tamponato (controllo negativo) sono state aggiunte rispettivamente ai micro pozzetti superiore, centrale e inferiore. L’incubazione è stata quindi eseguita in un ambiente buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Le cellule batteriche sono state quindi rilevate nei micro pozzetti. Il dispositivo microfluidico SlipChip, tuttavia, era costoso. Pertanto, ciascuno dei metodi sopra descritti presentava vantaggi e svantaggi.
Abbiamo stabilito un test di chemiotassi migliorato per la rapida identificazione di chemioattrattivi rizobatterici negli essudati radicali utilizzando vetrini sterili senza passaggi complicati. In questo studio, attraverso molteplici confronti di risultati sperimentali, il metodo ha superato molteplici carenze dei tradizionali metodi di chemiotassi batterica. Il metodo ha ridotto l’errore di conteggio delle piastre e abbreviato il ciclo sperimentale. Pertanto, se utilizzato per identificare una sostanza chemioattrattante, questo nuovo metodo può risparmiare 2-3 giorni e ridurre il costo dei materiali sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
La crescente ricerca indica che le interazioni pianta-batteri si verificano principalmente nella rizosfera e sono influenzate dagli essudati radicali20,21,22,23,24. Gli essudati delle radici delle piante comprendono una vasta gamma di metaboliti primari, tra cui acidi fenolici, acidi organici e amminoacidi, nonché composti secondari più complessi25,26,27.<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31870493), dai progetti chiave di ricerca e sviluppo a Heilongjiang, in Cina (GA21B007) e dalle tasse di ricerca di base delle università nella provincia di Heilongjiang, in Cina (n. 135409103).
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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