हम मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा उम्र-निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के गुर्दे और सीरम में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) छोटे, नॉनकोडिंग आरएनए होते हैं जिनमें 21-25 बेस होते हैं। उनका प्रोटीन में अनुवाद नहीं किया जाता है, बल्कि उन्हें अस्थिर करके और उनके अनुवाद को बाधित करके उनके लक्षित संदेशवाहक आरएनए (एमआरएनए) के कामकाज को बाधित करने के लिए काम किया जाता है। यद्यपि विभिन्न माउस अंगों और ऊतकों में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच की गई है, माउस किडनी और सीरम एमआईआरएनए को शुद्ध करने और मापने के लिए कोई मानक तरीके नहीं हैं। हमने उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के सीरम और गुर्दे में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति को निकालने और मूल्यांकन करने के लिए एक प्रभावी और विश्वसनीय तरीका स्थापित किया है।
विधि मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करती है, और प्रोटोकॉल को छह चरणों की आवश्यकता होती है: (1) सेनेसेंस-त्वरित माउस प्रतिरोध 1 (एसएएमआर 1) चूहों और सेनेसेंस-त्वरित माउस प्रवण (एसएएमपी 1) चूहों की तैयारी; (2) इन चूहों से सीरम नमूने निकालना; (3) प्रत्येक माउस से एक गुर्दे का नमूना निकालना; (4) प्रत्येक माउस से गुर्दे और सीरम नमूनों से कुल आरएनए (एमआईआरएनए सहित) निकालना; (5) एमआईआरएनए से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के साथ पूरक डीएनए (सीडीएनए) का संश्लेषण; (6) प्राप्त सीडीएनए का उपयोग करके क्यूआरटी-पीसीआर का संचालन करना।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया गया था कि, नियंत्रण की तुलना में, एमआईआरएनए -7218-5 पी और एमआईआरएनए -7219-5 पी की अभिव्यक्ति उम्र-निर्भर गुर्दे की हानि के माउस मॉडल के गुर्दे और सीरम में काफी बदल गई थी। इस प्रोटोकॉल ने उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के माउस मॉडल के गुर्दे और सीरम के बीच संबंध को भी स्पष्ट किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के गुर्दे और सीरम में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।
विभिन्न एमआरएनए की अभिव्यक्ति जो शरीर विज्ञान और रोग दोनों (जैसे, सूजन, फाइब्रोसिस, चयापचय विकार और कैंसर) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, एमआईआरएनए द्वारा विनियमित होने के लिए जानी जाती है, जो छोटे, नॉनकोडिंग आरएनए हैं जो गिरावट का कारण बनते हैं और एमआरएनए1 के प्रतिलेखन को रोकते हैं। इसलिए, यह संभव है कि कुछ एमआईआरएनए विभिन्न बीमारियों 2,3,4,5 के लिए नए उम्मीदवारों और / या चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में काम कर सकते हैं। विभिन्न प्रकार के माउस अंगों और ऊतकों (मस्तिष्क6, हृदय7, फेफड़े8, यकृत9 और गुर्दे10 सहित) में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर शोध किया गया है। हालांकि, उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि वाले चूहों के गुर्दे या सीरम में एमआईआरएनए निकालने और मूल्यांकन करने के लिए कोई मानक या स्थापित तरीके नहीं हैं।
इसलिए, हमने एक प्रोटोकॉल स्थापित किया जिसका उपयोग उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि वाले चूहों के सीरम और गुर्दे में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति को मज़बूती से शुद्ध करने और पता लगाने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में छह मुख्य चरण हैं: (1) 50 सप्ताह के एसएएमआर 1 नर चूहों और एसएएमपी 1 नर चूहों दोनों की तैयारी; (2) चूहों के दोनों उपभेदों के अवर वेना कावा से रक्त के नमूनों का निष्कर्षण, हेपरिन के साथ एक स्पिट्ज ट्यूब के बाद के उपयोग के साथ, सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सीरम नमूना प्राप्त करने के लिए; (3) चूहों से गुर्दे का नमूना निष्कर्षण- एक सिलिकॉन होमोजेनाइज़र का उपयोग गुर्दे के नमूने को अलग से समरूप बनाने के लिए किया जाता है, और नमूना तब माइक्रोसेंट्रिफुग स्पिन कॉलम11 पर बायोपॉलिमर-श्रेडिंग सिस्टम में स्थानांतरित किया जाता है; (4) सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम12 के उपयोग के साथ सीरम नमूनों से कुल आरएनए (एमआईआरएनए युक्त) निष्कर्षण और सिलिका झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम11 के उपयोग के साथ गुर्दे के नमूनों से एमआईआरएनए निष्कर्षण युक्त कुल आरएनए; (5) रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, पॉली (ए) पोलीमरेज़ और ओलिगो-डीटी प्राइमर13,14 का उपयोग करके कुल आरएनए से पूरक डीएनए (सीडीएनए) का संश्लेषण; और (6) अंत में, क्यूआरटी-पीसीआर और एक इंटरकेलेटिंग डाई13,14 का उपयोग करके एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का निर्धारण।
यह नया प्रोटोकॉल उन अध्ययनों पर आधारित था जो विभिन्न प्रकार के ऊतक 11,12,13 में एमआईआरएनए को निकालने और मूल्यांकन करने में सफल रहे। प्रोटोकॉल की बायोपॉलिमर-श्रेडिंग प्रणाली को ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को शुद्ध करने में सक्षम होने के लिए प्रदर्शित किया गया था11. एक इंटरकेलेटिंग डाई के साथ क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा एमआईआरएनए अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले इस प्रोटोकॉल के पहलुओं की सटीकता और संवेदनशीलता13,14 स्थापित की गई है, उदाहरण के लिए, निकाले गए कुल आरएनए से रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, पॉली (ए) पोलीमरेज़ और ओलिगो-डीटी प्राइमरों के साथ सीडीएनए संश्लेषण। नए प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं: सादगी, समय की बचत और कम तकनीकी त्रुटियां। इस प्रकार, इसका उपयोग उन जांचों के लिए किया जा सकता है जिनके लिए गुर्दे और सीरम एमआईआरएनए प्रोफाइल की सटीक और संवेदनशील पहचान की आवश्यकता होती है। कई रोग स्थितियों के अध्ययन भी नए प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं।
एसएएमपी 1 चूहों में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल, जो आयु-निर्भर गुर्दे की हानि का एक मॉडल है, नीचे दिखाए गए अनुसार निर्धारित किया जा सकता है। मनुष्यों में, आयु-निर्भर गुर्दे की हानि गुर्दे की विफलता की प्रगति से जुड़ी होती है और गुर्दे के अंतरालीय फाइब्रोसिस के क्षेत्र में वृद्धि और ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस15,16 की प्रगति दोनों की विशेषता है। आयु-निर्भर गुर्दे की हानि भी क्रोनिक किडनी रोग और अंत-चरण गुर्दे की बीमारी15,16 की एक महत्वपूर्ण और लगातार विशेषता है।
लक्ष्य एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करके उपरोक्त वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा सफलतापूर्वक निर्धारित किया गया था। निकाले गए एमआईआरएनए का मूल्यांकन सार्थक क्यूआरटी-पीसीआर डेटा प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। क्यूआरटी-पीसीआर करने से पहले एमआईआरएनए की पर्याप्त गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग 260 एनएम पर अवशोषण के अनुपात को 280 एनएम पर निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए। डीएनए संदूषण हो सकता है, और / या प्रतिक्रिया प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्राइमर डिमर मौजूद हो सकते हैं यदि क्यूआरटी-पीसीआर अपेक्षित लंबाई और पिघलने के तापमान का एक भी पीसीआर प्रवर्धन प्रदान नहीं करता है, या यदि यह एक मोनोमोडल पिघलने वक्र प्रदान करता है।
एमआईआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन क्यूआरटी-पीसीआर के अलावा कई तरीकों से किया जा सकता है, जिसमें उत्तरी सोख्ता, एक माइक्रोएरे और राइबोन्यूक्लिज संरक्षण परख शामिल हैं। हालांकि, क्यूआरटी-पीसीआर विधि एक संवेदनशील, सटीक, सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया है जिसके लिए उत्तरी सोख्ता और राइबोन्यूक्लिज संरक्षण परख19 के लिए आवश्यक लोगों की तुलना में एक छोटी नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है। चूंकि माइक्रोएरे एक साथ हजारों एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति को माप सकते हैं, इसलिए उनका उपयोग उम्मीदवार एमआईआरएनए मार्करों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। माइक्रोएरे डेटा क्यूआरटी-पीसीआर20 द्वारा प्राप्त डेटा के साथ एक उच्च समग्र सहसंबंध भी दिखाता है। तथापि, विभिन्न अध्ययनों में प्राप्त माइक्रोएरे डेटा की तुलना करने के लिए इष्टतम पद्धति के संबंध में कोई सर्वसम्मति नहीं बनीहै।
सीरम एमआईआरएनए के मूल्यांकन में निम्नलिखित विशेषताएं हैं। सबसे पहले, सीरम इकट्ठा करना आसान है, और जैसा कि सीरम एमआईआरएनए ठंड और विगलन, तापमान और एसिड के खिलाफ स्थिर हैं, एमआईआरएनए अच्छे बायोमार्कर हो सकते हैं। दूसरा, प्रजातियों के बीच एमआईआरएनए की उच्च होमोलॉजी है, और जानवरों के प्रयोगों के परिणाम आसानी से मनुष्यों के लिए एक्सट्रपलेशन किए जाते हैं। तीसरा, सीरम एमआईआरएनए ने चिकित्सीय दवाओं के रूप में उपयोग की क्षमता दिखाईहै 3. कई अध्ययनों से यह भी पता चला है कि अंगों में एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति का स्तर सीरम 22,23,24 में एमआईआरएनए के साथ सहसंबद्ध है। वर्तमान अध्ययन में, एमआईआरएनए -223-3 पी, जिनमें से गुर्दे के स्तर ने एसएएमआर 1 और एसएएमपी 1 चूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया, ने सीरम में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। इसके विपरीत, एमआईआरएनए -7218-5 पी और एमआईआरएनए -7219-5 पी, जिनमें से गुर्दे के स्तर ने एसएएमआर 1 और एसएएमपी 1 चूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया, सीरम में काफी तनाव अंतर दिखाया।
इस प्रोटोकॉल की निम्नलिखित सीमाएँ हैं। पहला, यकृत और फेफड़े जैसे अन्य अंगों में इसकी उपयोगिता सत्यापित नहीं की गई है, और दूसरा, चूहों, कुत्तों और सूअरों जैसे अन्य प्रयोगशाला जानवरों पर इसका परीक्षण नहीं किया गया है। कई शोध समूहों ने क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा एमआईआरएनए के शुद्धिकरण और पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है और बताया है कि इस प्रोटोकॉल ने ऊतकों और सीरम 13,14,22,23,24 से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की शुद्धि को सक्षम किया है। एमआईआरएनए 13,14,22,23,24 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस पद्धति को उच्च सटीकता और संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया गया है। वर्तमान अध्ययन के परिणाम दर्शाते हैं कि यह प्रोटोकॉल चूहों के सीरम और गुर्दे में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का सफलतापूर्वक पता लगा सकता है। इसलिए, प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के विकृतियों के साथ चूहों में सीरम और गुर्दे एमआईआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की सादगी के कारण, बड़ी संख्या में नमूनों को एक साथ संसाधित किया जा सकता है। गुर्दे की विभिन्न रोग स्थितियों में कई एमआईआरएनए की अभिव्यक्ति का विश्लेषण, इस प्रकार, यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकता है।
प्रोटोकॉल के कुछ पहलुओं को ध्यान में रखना है। कमरे के तापमान पर होने वाले शुद्ध एमआईआरएनए के क्षरण से बचने के लिए, एमआईआरएनए को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। गुर्दे के नमूनों को तब तक समरूप किया जाना चाहिए जब तक कि वे पूरी तरह से लाइसिस अभिकर्मक में भंग न हो जाएं। माउस किडनी में पर्याप्त मात्रा में संयोजी ऊतक होते हैं जो लाइसिस अभिकर्मक में अघुलनशील होते हैं, और इस प्रकार आगे के समरूपता के लिए एक कॉलम श्रेडर की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, उचित अंतर्जात नियंत्रण एमआईआरएनए (नमूनों के बीच स्थिर अभिव्यक्ति के साथ) को क्यूआरटी-पीसीआर प्रयोग के सेटअप में मान्य किया जाना चाहिए। ऐसा इसलिए है क्योंकि इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के दौरान विभिन्न पदार्थों का हस्तक्षेप अंतर्जात नियंत्रण एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को बदल सकता है, संभवतः परिणामों से समझौता कर सकता है। अंत में, यह पत्र उम्र पर निर्भर गुर्दे की हानि के साथ चूहों के सीरम और गुर्दे में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने, शुद्धि और मूल्यांकन के लिए एक क्यूआरटी-पीसीआर प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
The authors have nothing to disclose.
कोई नहीं।
1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |