피부 내의 제약 화합물을 시각화하고 정량화하기 위한 일관된 라만 산란 영상화 방법론이 기재되어 있다. 이 논문은 피부 조직 제제 (인간 및 마우스) 및 국소 제형 적용, 시공간 농도 프로파일을 정량화하기위한 이미지 획득 및 국소 약물 전달을 평가하기위한 예비 약동학 분석에 대해 설명합니다.
국소 제형 적용 후의 피부 약동학 (cPK)은 국소 생체 이용률 (BA)을 기계적으로 이해하기 위해 규제 및 약물 개발 과학자들에게 특히 관심이있는 연구 분야였습니다. 테이프 스트리핑, 진피 미세투석, 또는 진피 개방 유동 미세관류와 같은 반침습적 기술은 모두 매크로스케일 cPK를 정량화한다. 이러한 기술은 방대한 cPK 지식을 제공했지만 커뮤니티는 활성 제약 성분 (API) 침투 및 세포 수준에서의 투과에 대한 기계론적 이해가 부족합니다.
마이크로 스케일 cPK를 다루기 위한 한 가지 비침습적 접근법은 외인성 라벨이나 화학적 변형 없이 내재적 분자 진동을 선택적으로 표적으로 하는 코히어런트 라만 산란 영상(CRI)이다. CRI에는 API 또는 비활성 성분의 민감하고 선택적인 정량화를 가능하게 하는 두 가지 주요 방법인 일관된 안티스토크스 라만 산란(CARS)과 자극된 라만 산란(SRS)이 있습니다. CARS는 일반적으로 구조적 피부 정보를 도출하거나 화학적 대조를 시각화하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 분자 농도와 선형인 SRS 신호는 피부 층화 내의 API 또는 비활성 성분을 정량화하는 데 사용된다.
마우스 조직이 CRI를 갖는 cPK에 대해 일반적으로 활용되었지만, 국소 BA 및 생물학적 동등성 (BE)은 궁극적으로 규제 승인 전에 인간 조직에서 평가되어야합니다. 이 논문은 국소 BA 및 BE의 평가에서 정량적 약동학적 CRI 연구에 사용되는 생체외 피부를 제조하고 이미지화하는 방법론을 제시한다. 이 방법론은 시간이 지남에 따라 인간과 마우스 피부 내에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 API 정량화를 가능하게합니다. 지질이 풍부하고 지질이 부족한 구획 내의 농도뿐만 아니라 시간에 따른 총 API 농도가 정량화됩니다. 이들은 마이크로 및 매크로 스케일 BA의 추정에 활용되며, 잠재적으로 BE입니다.
국소 약물 제품 적용 후 cPK를 평가하기위한 방법론은 고전적인 시험관 내 투과 시험 (IVPT) 연구 1,2,3,4,5 및 테이프 스트리핑 6,7,8에서 개방 유동 미세 관류 또는 피부 미세 투석과 같은 추가 방법론으로 확장되었습니다 9,10,11, 12,13,14. 관심있는 질병에 따라 치료 작용의 잠재적으로 다양한 국소 부위가 있습니다. 따라서 API가 의도 된 로컬 작업 사이트에 도달하는 속도와 범위를 평가하기위한 해당 방법론이있을 수 있습니다. 앞서 언급한 각각의 방법론에는 장점이 있지만, 가장 큰 단점은 마이크로스케일 cPK 정보가 부족하다는 것입니다(즉, API가 어디로 가고 어떻게 퍼졌는지 시각화할 수 없음).
국소 BA와 BE를 추정하기 위해 관심있는 비침습적 방법론 중 하나는 CRI이며, 이는 CARS 및 SRS 현미경의 두 가지 이미징 양식으로 나눌 수 있습니다. 이러한 일관된 라만 방법은 비선형 라만 효과를 통해 분자의 화학적으로 특이적인 이미징을 가능하게합니다. CRI에서는 두 개의 레이저 펄스 트레인이 샘플 내에서 집중되고 스캔됩니다. 레이저 주파수 사이의 에너지 차이는 관심있는 화학 구조에 특정한 진동 모드를 목표로 설정됩니다. CRI 과정은 비선형적이기 때문에, 신호는 현미경 초점에서만 생성되어, 조직의 입체 약동학적 단층 촬영 이미징을 허용한다. cPK의 맥락에서, CARS는 지질이 풍부한 피부 구조물(15)의 위치와 같은 조직 구조 정보를 획득하는데 사용되어 왔다. 대조적으로, SRS는 그 신호가 농도에 따라 선형이기 때문에 분자 농도를 정량화하는 데 활용되었습니다. 생체외 피부 표본의 경우, 에피 방향(16 )에서 CARS를 수행하고 전송 모드(17)에서 SRS를 수행하는 것이 유리하다. 따라서, 얇은 조직 샘플은 SRS 신호 검출 및 정량화를 허용할 것이다.
모델 조직으로서, 누드 마우스 귀는 사소한 단점과 함께 몇 가지 장점을 제시합니다. 한 가지 장점은 조직이 이미 두께가 ~ 200-300 μm이고 추가 샘플 준비가 필요하지 않다는 것입니다. 또한, 몇몇 피부 층화는 하나의 시야(예를 들어, 각질층, 피지선(SGs), 지방세포, 및 피하 지방)16,18을 통해 축방향으로 초점을 맞추는 것에 의해 보여진다. 이것은 인간 피부 샘플로 이동하기 전에 피부 투과 경로 및 국소 BA 추정치의 예비 전임상 추정을 허용한다. 그러나, 누드 마우스 모델은 피부 구조(19)의 차이로 인한 생체내 시나리오로의 외삽의 어려움과 같은 한계를 제시한다. 누드 마우스 귀는 예비 결과를 얻는 훌륭한 모델이지만, 인간 피부 모델은 황금 표준입니다. 생체내 투과 동역학 20,21,22를 정확하게 재분석하기 위한 동결된 인간 피부의 적합성 및 적용성에 대한 다양한 논평이 있었지만, 동결된 인간 피부의 사용은 시험관내 API 투과 동역학의 평가를 위한 수용된 방법이다23,24,25 . 이 프로토콜은 마우스와 인간의 피부의 다양한 피부층을 시각화하면서 지질이 풍부하고 지질이 부족한 구조 내의 API 농도를 정량화합니다.
CRI는 조직 내 화합물을 구체적으로 시각화하기 위해 수많은 분야에서 활용되어 왔지만 국소적으로 적용된 의약품의 cPK를 조사하는 데는 한계가 있었습니다. CRI를 사용하여 국소 제품의 국소 BA / BE를 평가하려면 먼저 정확한 비교를 위해 표준화 된 프로토콜을 마련해야합니다. 피부로의 약물 전달을 위해 CRI를 사용한 이전의 노력은 데이터 내에서 가변성을 입증하였다. 이것은 CRI의 비교적 새로운 응용 프로그램이므로 신뢰할 수있는 결과18,26,27을 얻으려면 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 이 접근법은 라만 스펙트럼의 생물학적 침묵 영역에서 하나의 특정 파형만을 표적으로 삼는다. 그러나 대부분의 API와 비활성 성분은 지문 영역 내에서 라만 이동을 가지고 있습니다. 이것은 이전에 지문 영역의 조직에서 발생하는 고유 한 신호로 인해 문제를 제기했습니다. 최근의 레이저 및 계산 발전은 이러한 장벽을 제거했으며, 이는 또한 여기에 제시된 접근법(28)과 함께 활용 될 수 있습니다. 여기에 제시된이 접근법은 침묵 영역 (2,000-2,300 cm-1)에서 라만 시프트가있는 API의 정량화를 허용합니다. 이는 약물의 물리화학적 특성에 한정되지 않으며, 이는 앞서 언급한 일부 cPK 모니터링 방법론(29)의 경우일 수 있다.
이 프로토콜은 두꺼운 인간 피부 샘플이 두꺼운 샘플에 의한 광산란으로 인해 약물 제품 적용 후 최소한의 신호를 생성하기 때문에 다양한 제제에 대한 피부 두께의 샘플 대 샘플 변동성을 줄여야합니다. 이 원고의 목표는 재현 가능한 이미징 표준을 보장하는 조직 준비 방법론을 제시하는 것입니다. 또한, CRI 시스템은 잠재적인 오류 소스를 줄이고 신호 대 잡음을 최소화하기 위해 설명된 대로 설정됩니다. 그러나이 논문은 CRI 현미경의 지침 원칙 및 기술적 장점에 대해 논의하지 않을 것입니다 이것은 이전에 다루었 기 때문에30. 마지막으로, 실험의 성공 또는 실패를 결정하기 위해 결과를 해석 할 수 있도록 광범위한 데이터 분석 절차를 탐구합니다.
국소 BA / BE의 평가는 단일 방법이 생체 내 cPK를 완전히 특성화 할 수 없기 때문에 다각적 인 접근이 필요한 연구 영역입니다. 이 프로토콜은 일관된 라만 이미징을 기반으로 국소 의약품의 BA / BE를 평가하기위한 방법론을 제시합니다. 간과 될 수있는 첫 번째 포인트 중 하나는 특히 정량적 전송 SRS 이미징의 경우 피부 샘플이 얼마나 얇아야하는지입니다. 피부가 너무 두꺼우면(즉, 빛이 쉽게…
The authors have nothing to disclose.
저자들은 에반스 그룹의 Fotis Iliopoulos 박사와 Daniel Greenfield 박사에게이 원고에 대한 토론과 교정에 감사드립니다. 또한 저자는 LEO Pharma의 지원을 인정하고 싶습니다. 그림 2는 BioRender.com 로 작성되었습니다.
Tissue Preparation | |||
Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
Laser/microscope | |||
650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
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DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
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Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
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FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
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SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
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Lipid/Drug Imaging | |||
35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
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Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
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Data Analysis | |||
FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
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Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
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Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |