Den orala administreringen av dsRNA som produceras av bakterier, en leveransmetod för RNA-interferens (RNAi) som rutinmässigt används i Caenorhabditis elegans, tillämpades framgångsrikt här på vuxna myggor. Vår metod möjliggör robusta omvända genetikstudier och transmissionsblockerande vektorstudier utan användning av injektion.
RNA-interferens har varit ett starkt använt verktyg för omvänd genetisk analys i två decennier. Hos vuxna myggor har dubbelsträngad RNA (dsRNA) administrering utförts främst via injektion, vilket kräver betydande tid och inte är lämplig för fältapplikationer. För att övervinna dessa begränsningar presenterar vi här en effektivare metod för robust aktivering av RNAi genom oral leverans av dsRNA till vuxna Anopheles gambiae. Långa dsRNA producerades i Escherichia coli-stammen HT115 (DE3), och en koncentrerad suspension av värmedödade dsRNA-innehållande bakterier i 10% sackaros erbjöds på bomullsbollar ad-libitum till vuxna myggor. Bomullsbollar byttes ut varannan dag under behandlingens varaktighet. Användning av denna metod för att rikta in sig på doublesex (en gen som är involverad i könsdifferentiering) eller gaffelhuvud (som kodar för en transkriptionsfaktor för spottkörteln) resulterade i minskat målgenuttryck och / eller proteinimmunfluorescenssignal, mätt med kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) respektive fluorescenskonfokalmikroskopi. Defekter i spottkörtelns morfologi observerades också. Denna mycket flexibla, användarvänliga, billiga och tidseffektiva metod för dsRNA-leverans kan vara allmänt tillämplig på målgener som är viktiga för insektsvektorfysiologi och därefter.
Många sjukdomar överförs av myggor, vilket gör studien av myggfysiologi och genetik till ett viktigt företag. Användningen av RNAi i dessa organismer har varit framträdande under de senaste 20 åren och har möjliggörat funktionell karakterisering av många mygggener 1,2,3,4,5. Den vanligaste tekniken för dsRNA-leverans har varit mikroinjektion, vilket har nackdelarna att det kan skada myggorna och kräver betydande tid och ansträngning. Orala leveransmetoder för RNAi har testats, men främst i larvstadiet av myggorna 6,7,8,9. Oral leverans av dsRNA hos vuxna myggor har inte utforskats fullt ut och kan vara ett användbart verktyg för studier av vektorbiologi och vektorkontroll.
Malaria överförs av Anopheles myggor när en infekterad kvinnlig mygga tar en blodmåltid från en oinfekterad värd och injicerar saliv som innehåller malariaparasiter10. För att i slutändan överföras i myggans saliv måste parasiten övervinna många hinder, inklusive att undvika myggimmunsystemet, korsa midgutbarriären och invasion av spottkörtlarna11. Myggsaltkörtelns (SG) arkitektur är nyckeln till parasitinvasion och att arkitekturen styrs både av viktiga spottkörteluttryckta transkriptionsfaktorer såväl som determinanter för sexuell dimorfism. Flera mycket bevarade transkriptionsfaktorer krävs för cellulär specifikation och homeostatiskt underhåll av spottkörtlarna och för produktion och utsöndring av salivproteiner som fungerar vid blodmatning 12,13,14. Gaffelhuvud (Fkh) är en bevingad helixtranskriptionsfaktor som fungerar som en viktig regulator för insekts SG-struktur och funktion (baserat på studier i fruktflugor och silkesmaskmoth)15,16,17,18,19,20. I Drosophila SG fungerar Fkh med Salvia, en SG-specifik grundläggande helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktor, för att främja SG-överlevnad och salivproduktion19. En viktig, positiv medregulator för salivproduktion i Drosophila är CrebA, en välstuderad transkriptionsfaktor för leucin dragkedja som uppreglerar uttrycket av sekretoriska väggener 21,22,23. Det finns också en stark grad av morfologisk differentiering hos kvinnliga spottkörtlar som sannolikt spelar en nyckelroll, inte bara vid blodmatning utan också i parasiternas förmåga att invadera denna vävnad24.
Många av de gener som är involverade i att bestämma spottkörtelns överlevnad, struktur, fysiologi och sexuell dimorfism har komplexa spatiotemporala uttrycksprofiler 25,26,27, och de traditionella leveransmetoderna för dsRNA för att inducera RNAi är inte alltid effektiva för att rikta in sig på dessa typer av gener i denna eller andra vävnader. Oral leverans av dsRNA i larvstadiet Aedes aegypti och An. gambiae myggor har emellertid använts framgångsrikt för att tysta den kvinnospecifika formen av dsx-genen 9,28. Tidigare studier med dsRNA i myggsaltkörtlar fann att även om stora mängder dsRNA krävdes, var ljuddämpningseffekten relativt långvarig (minst 13 dagar)29. Här testades förmågan hos värmedödad E. coli-stam HT115 (DE3) som uttrycker sekvensspecifikt dsRNA för dsx, fkh eller CrebA att inducera RNAi-tystnad av dessa gener hos vuxna kvinnliga myggor. Oral administrering av dsRNA-inducerad gennedslagning i An. gambiae, med tydliga minskningar av mRNA-nivåer och med fenotyper som överensstämmer med funktionsförlusten hos dessa gener. Således kommer detta tillvägagångssätt sannolikt att fungera för att slå ner funktionen hos en mängd olika spottkörtelgener.
Förmågan att effektivt leverera dsRNA till An. gambiae myggor genom oral utfodring har breda konsekvenser för studier av vektorbiologi både i laboratoriet och i fältet. Mikroinjektion har länge accepterats som det föredragna sättet att leverera kemikalier, antikroppar, RNAi och genetiska modifieringsstrategier hos myggor43,44. Konsekvensen av väsentlig fysisk manipulation, cellskador och stress kan undvikas genom användning av oral leverans, vilket också kan vara potentiellt lämpligt för storskaliga eller fältapplikationer. Tidigare arbete har föreslagit att RNAi verkar allestädes närvarande inom en enskild vuxen mygga29, vilket möjliggör effekter i alla vävnader, inklusive spottkörtlar. Genom att mata myggor med ett stort antal dsRNA-uttryckande E. coli som smälts asynkront under en lång tidsram kan man potentiellt uppnå konsekvent och enhetlig exponering för RNAi över alla individer i en bur. Denna metod gör det möjligt att mata ett stort antal myggor och analysera potentiell variation av de resulterande fenotyperna beroende på målgenen. En viktig faktor är emellertid möjligheten till heterogen fördelning av bakterierna, och därmed dsRNA, i bomullsfibern. De 400 μL bakterier som används dagligen för myggsockermatning skulle innehålla cirka ≤4,6 μg dsRNA, som beskrivits och beräknats tidigare9 men mängden dsRNA som intas av varje mygga bestämdes inte individuellt. Om byggandet av dsRNA-konstruktioner blir rutinmässigt möjliggör detta enkla behandlingsprotokoll snabb assimilering av denna teknik av någon myggforskare. A priori är tidsutgifterna under behandlingen (30 min per dag) triviala jämfört med den tid det tar att lära sig och applicera mikroinjektion på liknande provstorlekar.
Feeding dsRNA används rutinmässigt för omvänd genetik studier i modellorganismen Caenorhabditis elegans45. Denna tunga användningsnivå understryker värdet av den muntliga leveransmetoden. Konstruktion av ett An. gambiae genomomfattande bibliotek i transformerad E. coli, liknande den som finns i C. elegans46,47, skulle möjliggöra snabb omvänd genetisk screening hos myggor i ökad skala. Det är dock viktigt att notera att metodens effektivitet i hög grad beror på de endogena nivåerna av transkript och om uttrycket inte är begränsat till målvävnaden utan uttryckt bredare 4,8,44. Dessutom finns det bevis för att vissa insekticider kan inducera beteendemässig undvikande från myggor48, och utfodring med bakterier som potentiellt inducerar negativa effekter i dem kan utlösa liknande mönster av undvikande. I laboratoriets kontrollerade miljö, där myggorna inte hade en alternativ matkälla, hade de inget val att undvika sockervattnet med E. coli och behovet av en näringsrik källa skulle förmodligen åsidosätta instinkten att undvika bakterierna. Detta bör dock övervägas om strategin var avsedd att användas i mindre kontrollerade miljöer.
Det kan vara möjligt att rikta in sig på flera gener samtidigt (med hjälp av en konstruktion, flera konstruktioner eller en blandning av transformerade bakterieisolat), men ytterligare studier behövs för att bedöma effektiviteten. En annan viktig faktor för denna punkt är utvärderingen av möjliga off-target eller synergistiska effekter vid användning av enstaka eller flera mål. Upprättandet av lämpliga kontrollgener och grupper är en viktig del av den experimentella designen. Vidare är det frestande att spekulera i att detta tillvägagångssätt kan användas för att rikta in sig på andra patogener eller virus49. Tidigare arbete mot RNAi-induktion i myggor utfördes under förhållanden där reagenset injicerades direkt, så E. coli var inte närvarande. E. coli kan ge ett skyddande fack som möjliggör långsammare frisättning av dsRNA över tiden, vilket säkerställer att exponeringen är mer eller mindre kontinuerlig under en mycket längre period29.
Slutligen visar dessa resultat att effekterna av denna teknik är avstämbara genom att justera tidsramen (längd och startdag) för exponering och mängden E. coli som används. Denna funktion gjorde det möjligt för oss att studera funktionerna hos väsentliga gener (dsx och fkh) genom att identifiera optimala knockdown-förhållanden genom försök och fel. Detta ökar kraftigt sannolikheten för att målgener av intresse kan undersökas med hjälp av denna teknik.
Sammanfattningsvis konstaterades att oral leverans av RNAi till vuxna myggor kan vara enkel, mångsidig och ett kraftfullt tillvägagångssätt för att studera mygggenfunktion och för att skapa nya och formbara verktyg för vektorkontroll av myggburna sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka personalen och forskarna inom Entomology Branch och Division of Parasitic Diseases and Malaria vid CDC, och Brian Trigg och Michelle Chiu för hjälp med bakterieberedning vid JHU och / eller hjälpsamma diskussioner om detta arbete. Vi tackar JHMRI Insectary och manager Chris Kizito för tillgång till och uppfödning av An. gambiae myggor. Vi tackar Wei Huang (JHSPH) för hjälp med att erhålla plasmider PJet GFP och pPB47 GFP för användning i denna studie. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av: NIH R21AI153588 (till DJA), ett Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship (till MW); och genom ett bidrag från Good Ventures Foundation och Open Philanthropy Project till CDC Foundation med titeln Support cryopreservation and suppression of female development in mosquitoes to assist research for malaria, Open Philanthropy Project, 2017. Vi uppskattar djupt hjälp från JHU Microscope Facility-personalen och tillämpligt NIH-bidragsstöd för det mikroskop som används (NIH Grant #: S10OD016374). Resultaten och slutsatserna i detta manuskript är författarnas och representerar inte nödvändigtvis CDC: s åsikter. Användning av handelsnamn är endast för identifiering och innebär inte godkännande av Centers for Disease Control and Prevention, Public Health Service eller US Department of Health and Human Services.
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
BugDorm | BioQuip | 1452 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Damiens diet | BioServ | ||
DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
pGEMT easy | Promega | A3600 | |
Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
ANTIBODIES | |||
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
PRIMERS | |||
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |