Lichtgesteuerte Fermentationen für die mikrobielle Chemikalien- und Proteinproduktion

Summary

Die optogenetische Kontrolle des mikrobiellen Stoffwechsels bietet eine flexible dynamische Kontrolle über Fermentationsprozesse. Das Protokoll zeigt hier, wie man blaulichtregulierte Fermentationen für die chemische und Proteinproduktion auf verschiedenen volumetrischen Skalen aufbaut.

Abstract

Mikrobielle Zellfabriken bieten eine nachhaltige Alternative zur Herstellung von Chemikalien und rekombinanten Proteinen aus nachwachsenden Rohstoffen. Die Überlastung eines Mikroorganismus mit genetischen Veränderungen kann jedoch die Fitness und Produktivität des Wirts verringern. Dieses Problem kann durch dynamische Kontrolle überwunden werden: induzierbare Expression von Enzymen und Signalwegen, typischerweise unter Verwendung von chemischen oder nährstoffbasierten Zusätzen, um das Zellwachstum und die Zellproduktion auszugleichen. Die Optogenetik bietet eine nicht-invasive, hochgradig abstimmbare und reversible Methode zur dynamischen Regulierung der Genexpression. Hier beschreiben wir, wie man lichtgesteuerte Fermentationen von technisch hergestellten Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung von Chemikalien oder rekombinanten Proteinen aufbaut. Wir diskutieren, wie Licht zu ausgewählten Zeiten und Dosierungen angewendet werden kann, um mikrobielles Wachstum und Produktion für eine verbesserte Fermentationskontrolle und Produktivität zu entkoppeln, sowie die wichtigsten Optimierungsüberlegungen für beste Ergebnisse. Darüber hinaus beschreiben wir, wie Lichtsteuerungen für Bioreaktorexperimente im Labormaßstab implementiert werden können. Diese Protokolle erleichtern die Einführung optogenetischer Kontrollen in technisch hergestellten Mikroorganismen zur Verbesserung der Fermentationsleistung.

Introduction

Die Optogenetik, die Steuerung biologischer Prozesse mit lichtempfindlichen Proteinen, bietet eine neue Strategie zur dynamischen Steuerung mikrobieller Fermentationen für die chemische und ^{Proteinproduktion1,2}. Die Belastung durch technische Stoffwechselwege und die Toxizität einiger Zwischenprodukte und Produkte beeinträchtigen häufig das ^{Zellwachstum3.} Solche Belastungen können zu einer schlechten Biomasseakkumulation und einer verminderten Produktivität ^führen3. Dieser Herausforderung kann begegnet werden, indem die Fermentationen zeitlich in eine Wachstums- und Produktionsphase unterteilt werden, die metabolische Ressourcen der Biomasseakkumulation bzw. Produktsynthese ^widmen4. Wir haben kürzlich gezeigt, dass der Übergang vom Wachstum zur Produktion in dieser zweiphasigen Fermentation mit Änderungen der Beleuchtungsbedingungen induziert werden ^kann5,6,7. Die hohe Abstimmbarkeit, Reversibilität und Orthogonalität von Lichteinträgen8 bieten einzigartige Vorteile für lichtgesteuerte Fermentationen, die mit chemischen Induktoren, die zur dynamischen Steuerung herkömmlicher Zweiphasenfermentationen eingesetzt werden, schwer oder gar nicht repliziert werden ^{können4,9,10,11}.

Das blaulichtempfindliche Protein EL222, das aus Erythrobacter litoralis gewonnen wird, wurde verwendet, um mehrere optogenetische Schaltkreise für das Metabolic Engineering in Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13 zu entwickeln. EL222 enthält eine LOV-Domäne (Light-Oxygen-Voltage-Sensor), die bei Blaulichtaktivierung (465 nm) eine Konformationsverschiebung erfährt, wodurch sie an ihre verwandte DNA-Sequenz (^C120)13 binden kann. Die Fusion von EL222 mit der viralen VP16-Aktivierungsdomäne (VP16-EL222) führt zu einem auf Blaulicht reagierenden Transkriptionsfaktor, der die Genexpression in S. cerevisiae7 und anderen Organismen14 aus dem synthetischen Promotor _PC120 reversibel aktivieren kann. Mehrere Schaltkreise, die auf EL222 basieren, wurden für die chemische Produktion in S. cerevisiae entwickelt und verwendet, wie das grundlegende lichtaktivierte OptoEXP-System7, in dem das Gen von Interesse direkt aus _PC120 exprimiert wird (Abbildung 1A). Bedenken hinsichtlich der Lichtdurchdringung bei den hohen Zelldichten, die typischerweise in der Produktionsphase von Fermentationen auftreten, motivierten uns jedoch, invertierte Schaltkreise zu entwickeln, die im Dunkeln induziert werden, wie die OptoINVRT- und OptoQ-INVRT-Schaltungen (Abbildung 1B) ^5,7,13. Diese Systeme nutzen die Galactose- (GAL) oder Chinainsäure (Q)-Regulone aus S. cerevisiae bzw. N. crassa und kontrollieren ihre entsprechenden Repressoren (GAL80 und QS) mit VP16-EL222, um die Genexpression im Licht zu unterdrücken und im Dunkeln stark zu induzieren. Die Kombination von OptoEXP- und OptoINVRT-Schaltkreisen führt zu einer bidirektionalen Kontrolle der Genexpression und ermöglicht zweiphasige Fermentationen, bei denen die Wachstumsphase mit blauem Licht und die Produktionsphase mit Dunkelheit induziert wird (Abbildung 2A) ^5,7.

Die Verwendung von Licht anstelle von Dunkelheit zur Induktion der Genexpression während der Produktionsphase würde die Fähigkeiten der optogenetischen Kontrollen erheblich erweitern, würde aber auch die Überwindung der Lichtdurchdringungsbeschränkungen der hohen Zelldichten erfordern, die typischerweise in dieser Phase der Fermentation auftreten. Zu diesem Zweck haben wir Schaltkreise entwickelt, die als OptoAMP und OptoQ-AMP bekannt sind und die transkriptionelle Reaktion auf die Blaulichtstimulation verstärken. Diese Schaltkreise verwenden Wildtyp- oder überempfindliche Mutanten von VP16-EL222, um die Produktion der transkriptionellen Aktivatoren Gal4p oder QF2 der GAL- bzw. Q-Regulonen zu kontrollieren und eine erhöhte Empfindlichkeit und stärkere Genexpression mit Licht zu ^{erreichen12,13} (Abbildung 1C). OptoAMP-Schaltungen können eine vollständige und homogene Lichtinduktion in 5-L-Bioreaktoren bei einer optischen Dichte (gemessen bei 600 nm; _OD600) Werte von mindestens 40 mit nur ~0,35% der Beleuchtung (5% Lichtdosis auf nur ~7% der Schüttfläche). Dies zeigt eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu OptoEXP, das eine Beleuchtung von nahezu 100% ^erfordert12. Die Fähigkeit, die Genexpression mit Licht bei hohen Zelldichten effektiv zu induzieren, eröffnet neue Möglichkeiten zur dynamischen Steuerung von Fermentationen. Dazu gehören Betriebsfermentationen in mehr als zwei zeitlichen Phasen, wie z. B. dreiphasige Fermentationen, bei denen Wachstums-, Induktions- und Produktionsphasen mit einzigartigen Lichtplänen zur Optimierung der chemischen Produktion festgelegt werden (Abbildung 2B)¹².

Abbildung 1: Optogenetische Schaltkreise zur dynamischen Regelung von S. cerevisiae. Die Schaltungen OptoEXP, OptoINVRT und OptoAMP basieren auf dem lichtempfindlichen VP16-EL222-System. (A) Im OptoEXP-Kreislauf führt die Exposition gegenüber blauem Licht zu einer Konformationsänderung und Dimerisierung von VP16-EL222, die eine DNA-bindende Domäne freilegt und eine Transkription von _PC120 ermöglicht. Die Figur wurde von Zhao et ^al.7 modifiziert. (B) OptoINVRT-Schaltungen nutzen die GAL (siehe abgebildeten) oder Q-Regulinen, um die Expression im Dunkeln zu induzieren. In GAL-basierten Schaltungen werden VP16-EL222 und GAL4 konstitutiv ausgedrückt, während _{PC120-Laufwerke} Ausdruck des GAL80-Repressors erzeugen (in Q-basierten Schaltungen werden GAL4 und GAL80 durch QF2 bzw. QS ersetzt, und anstelle eines GAL-Promotors wird ein synthetischer QUAS-haltiger Promotor verwendet). Im Licht verhindert Gal80p die Aktivierung des interessierenden Gens aus _PGAL1. Im Dunkeln wird GAL80 nicht exprimiert und schnell abgebaut, indem es zu einer konstitutiven Degron-Domäne (kleine braune Domäne) verschmolzen wird, was die Aktivierung von _PGAL1 durch Gal4p ermöglicht. Die Figur wurde von Zhao et ^al.5 modifiziert. (C) OptoAMP-Schaltungen verwenden auch VP16-EL222 zur Steuerung der GAL- (siehe abgebildeten) oder Q-Regulien. In diesen Schaltkreisen wird der GAL80-Repressor (oder QS) konstitutiv ausgedrückt und mit einem lichtempfindlichen Degron (kleine blaue Domäne) verschmolzen, der eine strenge Unterdrückung im Dunkeln gewährleistet. _PC120 und eine überempfindliche VP16-EL222-Mutantenkontrollexpression von GAL4 (oder QF2) mit Licht, die _PGAL1 (oder einen QUAS-haltigen Promotor) im Licht stark aktiviert. GAL-abgeleitete Schaltungen können technische Formen von PGAL1 verwenden, wie PGAL1-M oder PGAL1-S, die eine erhöhte Aktivität aufweisen, sowie Wildtyp-Promotoren, die von der _{GAL-Regulierung} kontrolliert werden (PGAL1, PGAL10, PGAL2, _PGAL7). Die Figur wurde von Zhao et ^al.12 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Zwei- und dreiphasige Fermentationen im Laufe der Zeit . (A) Zweiphasige Fermentationen, die mit invertierten Schaltkreisen betrieben werden, bestehen aus einer lichtgetriebenen Wachstumsphase und einer dunklen Produktionsphase. In der Wachstumsphase reichert sich Biomasse an, da der Produktionsweg unterdrückt bleibt. Nach Erreichen des gewünschten _OD600 werden die Zellen ins Dunkel verschoben, um sich metabolisch anzupassen, bevor sie für die Produktionsphase in frischen Medien resuspendiert werden. (B) In einem dreiphasigen Prozess werden die Wachstums-, Inkubations- und Produktionsphasen durch einzigartige Lichtpläne definiert, die aus einer dunklen Wachstumsperiode, einer gepulsten Inkubation und einer vollständig beleuchteten Produktionsphase bestehen können. Mit Biorender erstellte Figur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Optogenetische Schaltkreise wurden auch für die dynamische Steuerung der chemischen und Proteinproduktion in E. coli entwickelt. OptoLAC-Schaltungen steuern den bakteriellen LacI-Repressor über die lichtempfindliche pDawn-Schaltung, die auf dem Zweikomponentensystem YF1/FixJ6 basiert (Abbildung 3^). Ähnlich wie OptoINVRT5 sind OptoLAC-Schaltkreise so konzipiert, dass sie die Genexpression im Licht unterdrücken und im Dunkeln induzieren. Die Expressionsniveaus, die OptoLAC-Schaltungen verwenden, können mit denen der Standard-Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid-Induktion (IPTG) mithalten oder diese übertreffen, wodurch die Festigkeit der chemischen Induktion erhalten bleibt und gleichzeitig eine verbesserte Abstimmbarkeit und Reversibilität geboten ^wird6. Daher ermöglichen OptoLAC-Schaltkreise eine effektive optogenetische Kontrolle für das Metabolic Engineering in E. coli.

Abbildung 3: OptoLAC-Schaltungen zur dynamischen Regelung von E. coli. Die OptoLAC-Schaltungen passen das pDawn-System und das lac-Operon an, um eine Aktivierung im Dunkeln und eine Unterdrückung im Licht zu erreichen. Im Dunkeln phosphoryliert YF1 FixJ, wodurch dann der _{PFixK2-Promotor} aktiviert wird, um den cI-Repressor auszudrücken. Der cI-Repressor verhindert die Expression des lacI-Repressors aus dem _PR-Promotor, der die Transkription des interessierenden Gens von einem lacO-haltigen Promotor ermöglicht. Umgekehrt reduziert blaues Licht die YF1-Nettokinaseaktivität, kehrt die FixJ-Phosphorylierung und damit die cI-Expression um, was die Expression von lacI unterdrückt und die Expression durch den lacO-haltigen Promotor verhindert. Die Figur wurde von Lalwani et ^al.6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Wir beschreiben hier die grundlegenden Protokolle für lichtgesteuerte Fermentationen von S. cerevisiae und E. coli zur chemischen oder Proteinproduktion. Sowohl für Hefe als auch für Bakterien konzentrieren wir uns zunächst auf Fermentationen mit einer lichtgetriebenen Wachstumsphase und einer dunkelheitsinduzierten Produktionsphase, die durch OptoINVRT- und OptoLAC-Schaltkreise ermöglicht wird. Anschließend beschreiben wir ein Protokoll für eine dreiphasige (Wachstum, Induktion, Produktion) lichtgesteuerte Fermentation, die durch OptoAMP-Schaltungen ermöglicht wird. Darüber hinaus beschreiben wir, wie optogenetisch kontrollierte Fermentationen von Mikrotiterplatten auf Bioreaktoren im Labormaßstab hochskaliert werden können. Mit diesem Protokoll wollen wir einen vollständigen und leicht reproduzierbaren Leitfaden für die Durchführung lichtgesteuerter Fermentationen für die chemische oder Proteinproduktion bereitstellen.

Protocol

1. Lichtgesteuerte chemische Produktion mit dem S. cerevisiae OptoINVRT7 Schaltkreis Dehnungsbau Erhalten Sie einen Stamm mit his3-Auxotrophie, da dieser Marker für die meisten vorhandenen OptoINVRT-Plasmide5 erforderlich ist. Wenn Sie eine optogenetische Regulation eines Gens anstreben, das in S. cerevisiae beheimatet ist, konstruieren Sie einen Stamm, bei dem jede endogene Kopie des Gens gelöscht wird. Linearisieren Sie…

Representative Results

Die optogenetische Regulation des mikrobiellen Stoffwechsels wurde erfolgreich zur Herstellung einer Vielzahl von Produkten implementiert, darunter Biokraftstoffe, Massenchemikalien, Proteine und Naturstoffe5,6,7,12,13. Die meisten dieser Prozesse sind so konzipiert, dass das Zellwachstum im Licht stattfindet (wenn eine niedrige Zelldichte minimale Herausforde…

Discussion

Dynamische Kontrolle wird seit langem angewendet, um die Ausbeute für metabolisches Engineering und rekombinante Proteinproduktion zu ^verbessern4. Verschiebungen in der enzymatischen Expression werden am häufigsten mit chemischen Induktoren wie IPTG21, Galactose22 und ^{Tetracyclin23} durchgeführt, aber auch unter Verwendung von Prozessbedingungen wie Temperatur und pH-Wert vermittelt. Die optogenetische Kontrolle der Genexpre…

Materials

Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate	USA Scientific	CC7672-7524
Agar powder	Thermo Fisher Scientific	303991049
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid	N/A	N/A	See Reference 1
Glucose	Thermo Fisher Scientific	501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Petri dish	Celltreat	229656
PmeI	New England Biolabs	R0560L
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
Replica-plating device	Thomas Scientific	F37848-0000
Replica-plating pads	Sunrise Science Products	3005-012
SC-His powder	Sunrise Science Products	1303-030
SC Complete powder	Sunrise Science Products	1459-100
Sterile sealing film	Excel Scientific	STR-SEAL-PLT
YPD agar plates	VWR	100217-054
Zeocin	Thermo Fisher Scientific	R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer	Cepham Life Sciences	10502
12% Acrylamide protein gels	Thermo Fisher Scientific	NP0341BOX
24-well culture plate	USA Scientific	CC7672-7524
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250	Thermo Fisher Scientific	20279
Electrophoresis cell	Bio-Rad	1658004
Electrophoresis power supply	Bio-Rad	1645050
LB broth (Miller)	Fisher Scientific	BP97235
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
NaCl	Thomas Scientific	SX0425-1
OptoLAC plasmids	N/A	N/A	See Reference 2
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Petri dish	Celltreat	229656
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
SOC medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Thermomixer	Eppendorf	5382000015
Tris base	Fisher Scientific	BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid	N/A	N/A	See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
Antifoam	Sigma-Aldrich	A8311
Bioreactor with control station	Eppendorf	B120110001
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Bleach	VWR Scientific	89501-620 (CS)
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
BPT tubing	Fisher Scientific	14-170-15
Glucose	Thermo Fisher Scientific	501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	7647-01-0
M9 Minimal Salts	Thermo Fisher Scientific	A1374401
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
NH4OH Solution	Sigma-Aldrich	I0503-1VL
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
SC Complete powder	Sunrise Science Products	1459-100