التقييم الوظيفي ل Kinesin-7 CENP-E في الخلايا المنوية باستخدام تثبيط الجسم الحي والتألق المناعي وقياس التدفق الخلوي
Summary
تشير هذه المقالة إلى تثبيط CENP-E في الجسم الحي من خلال جراحة البطن وحقن الخصية GSK923295 ، وهو نموذج قيم لانقسام الانقسام الاختزالي للذكور. باستخدام التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي ومقايسات المجهر الإلكتروني النافذ ، نظهر أن تثبيط CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم وعدم استقرار الجينوم في الخلايا المنوية للفئران.
Abstract
في حقيقيات النوى، يعد الانقسام الميوزي ضروريا لاستقرار الجينوم والتنوع الجيني في التكاثر الجنسي. تعتبر التحليلات التجريبية للخلايا المنوية في الخصيتين حاسمة للتحقيقات في تجميع المغزل وفصل الكروموسومات في الانقسام الاختزالي الذكري. تعتبر الخلايا المنوية للفأر نموذجا مثاليا للدراسات الميكانيكية للانقسام الاختزالي ، ومع ذلك ، فإن الطرق الفعالة لتحليل الخلايا المنوية غير متوفرة. في هذه المقالة ، تم الإبلاغ عن طريقة عملية وفعالة لتثبيط kinesin-7 CENP-E في الخلايا المنوية للفئران. يتم تقديم إجراء مفصل لحقن الخصية لمثبط معين GSK923295 من خلال جراحة البطن في الفئران البالغة من العمر 3 أسابيع. علاوة على ذلك ، الموصوفة هنا هي سلسلة من البروتوكولات لجمع الأنسجة وتثبيتها ، وتلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين ، والتألق المناعي ، وقياس التدفق الخلوي ، والمجهر الإلكتروني النافذ. نقدم هنا نموذج تثبيط في الجسم الحي عن طريق جراحة البطن وحقن الخصية ، والتي يمكن أن تكون تقنية قوية لدراسة الانقسام الاختزالي عند الذكور. كما نوضح أن تثبيط CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم وتوقف الطور الاستوائي في الخلايا المنوية الأولية أثناء الانقسام الاختزالي الأول. ستسهل طريقة التثبيط في الجسم الحي لدينا الدراسات الميكانيكية للانقسام الاختزالي ، وستكون بمثابة طريقة مفيدة للتعديلات الجينية لخطوط الجراثيم الذكرية ، وتلقي الضوء على التطبيقات السريرية المستقبلية.
Introduction
الانقسام الميوزي هو أحد أهم الأحداث التطورية المحفوظة في الكائنات حقيقية النواة ، وهو ضروري لتكوين الأمشاج ، والتكاثر الجنسي ، وسلامة الجينوم ، والتنوع الجيني1،2،3. في الثدييات، تخضع الخلايا الجرثومية لانقسامين خلويين متتاليين، الانقسام الميوزي الأول والثاني، بعد جولة واحدة من تضاعف الحمض النووي (DNA). على عكس الكروماتيدات الشقيقة في الانقسام الميتوزي، تتزاوج الكروموسومات المتماثلة المتضاعفة وتنفصل إلى خليتين بنويتين أثناء الانقسام الميوزيI 4، 5. في الانقسام الميوزي الثاني، تتفكك الكروماتيدات الشقيقة وتنفصل لتكوين جاميتات أحادية الصيغة الصبغية دون تضاعف الحمض النووي(DNA) 6. يمكن أن تؤدي الأخطاء في أي من القسمين الميوزيين ، بما في ذلك عيوب تجميع المغزل وفقدان الكروموسوم ، إلى فقدان الأمشاج أو العقم أو متلازمات اختلال الصيغة الصبغية7،8،9.
أظهرت الدراسات المتراكمة أن محركات عائلة كينيسين تلعب دورا مهما في تنظيم محاذاة الكروموسومات وفصلها ، وتجميع المغزل ، وتحريك الخلايا ، وتطور دورة الخلية في كل من الخلايا الانقسامية والانقسام الاختزالي10،11،12. Kinesin-7 CENP-E (بروتين Centromere E) هو محرك كينيتوكور موجه بشكل زائد مطلوب لكونغرس الكروموسوم ، ونقل الكروموسوم ومحاذاته ، وتنظيم نقطة تفتيش تجميع المغزل في الانقسامالفتيلي 13،14،15،16،17،18. أثناء الانقسام الاختزالي ، يؤدي تثبيط CENP-E بواسطة GSK923295 مثبط معين إلى توقف دورة الخلية ، واختلال محاذاة الكروموسوم ، وعدم تنظيم المغزل ، وعدم استقرار الجينوم في الخلايا المنوية19. تشير أنماط توطين وديناميكيات CENP-E عند السنتروميرات لتقسيم الخلايا المنوية إلى أن CENP-E يتفاعل مع بروتينات kinetochore للتجميع المتسلسل للسنتروميرات أثناء الانقسام الاختزالي I20,21. في البويضات ، يلزم CENP-E لمحاذاة الكروموسوم وإكمال الانقسام الاختزالي I13،22،23. ينتج عن الأجسام المضادة أو حقن المورفولينو ل CENP-E كروموسومات منحرفة ، واتجاه حركي غير طبيعي ، وتوقف الانقسام الاختزالي الأول في كل من بويضات الفئران وذبابة الفاكهة 23. بالمقارنة مع الأدوار الأساسية ل CENP-E في الانقسام الفتيلي ، لا تزال وظائف وآليات CENP-E في الانقسام الاختزالي غير معروفة إلى حد كبير. لا يزال يتعين توضيح الآليات التفصيلية ل CENP-E في تكوين الكروموسومات واستقرار الجينوم في الخلايا الاختزالية الذكرية.
تكوين الحيوانات المنوية هو عملية فسيولوجية معقدة وطويلة الأمد ، تتضمن تكاثر أمهات المني المتسلسل ، الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية. لذلك ، من الصعب للغاية إعادة إنتاج العملية برمتها في المختبر في الثدييات والأنواع الأخرى24,25. من المستحيل إحداث تمايز الخلايا المنوية بعد مرحلة الباكيتين في المختبر. اقتصرت الدراسات على الانقسامات الاختزالية للذكور بشكل عام على التحليلات التجريبية للطور الاختزالي المبكر25،26. على الرغم من العديد من المساعي التكنولوجية ، بما في ذلك الثقافة قصيرة المدى للخلايا المنوية 27،28 وطرق زراعة الأعضاء25 ، هناك عدد قليل من الطرق الفعالة لدراسة الانقسام الاختزالي الذكري. علاوة على ذلك ، عادة ما يؤدي الحذف الجيني للجينات الأساسية إلى توقف النمو والفتك الجنيني. على سبيل المثال ، تفشل أجنة الفئران التي تفتقر إلى CENP-E في الزرع ولا يمكنها تطوير عملية زرع سابقة29 ، وهو ما يمثل عقبة في الدراسات الميكانيكية ل CENP-E في الانقسام الاختزالي. مجتمعة ، يمكن أن يؤدي إنشاء نظام عملي وممكن لدراسة الانقسام الاختزالي للذكور إلى تعزيز مجال البحث في الانقسام الاختزالي بشكل كبير.
المثبط الصغير المنفذ للخلايا هو أداة قوية لدراسة محركات كينيسين في انقسام الخلايا وعمليات النمو. GSK923295 ، يرتبط مثبط الخيفي على وجه التحديد بالمجال الحركي CENP-E ، ويمنع إطلاق ADP (أدينوسين ثنائي الفوسفات) ، وأخيرا يستقر التفاعلات بين CENP-E والأنابيب الدقيقة30. في هذه الدراسة ، يتم تقديم نموذج فأر تثبيط في الجسم الحي من خلال جراحة البطن وحقن الخصية من GSK923295. يؤدي تثبيط CENP-E إلى اختلال الكروموسوم في الطور الأول من الخلايا المنوية الأولية. علاوة على ذلك ، يؤدي تثبيط CENP-E إلى توقف الانقسام الاختزالي للخلايا المنوية وتعطيل تكوين الحيوانات المنوية. تم وصف سلسلة من البروتوكولات لتحليل الخلايا المنوية ويمكن تطبيقها لمراقبة الأنابيب الدقيقة المغزلية الاختزالية والكروموسومات المتماثلة والعضيات تحت الخلوية في الخلايا المنوية. طريقة تثبيط الجسم الحي لدينا هي طريقة فعالة لدراسات الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذج تثبيط CENP-E في الجسم الحي لخصيتي الفئران باستخدام جراحة البطن والحقن المجهري GSK923295. تتميز طريقة جراحة البطن وحقن الخصية المستخدمة في هذه الدراسة بالمزايا التالية. أولا ، لا يقتصر على عمر الفئران. يمكن للمجربين إجراء حقن الخصية في مرحلة مبكرة ، على سبيل المث…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع أعضاء مختبر الهيكل الخلوي في جامعة فوجيان الطبية على المناقشات المفيدة. نشكر جون جين لين في مركز خدمات التكنولوجيا العامة ، جامعة فوجيان الطبية على المساعدة الفنية في قياس التدفق الخلوي. نشكر Ming-Xia Wu و Lin-Ying Zhou في مختبر المجهر الإلكتروني التابع لمركز خدمة التكنولوجيا العامة ، جامعة فوجيان الطبية للمساعدة الفنية في الفحص المجهري الإلكتروني. نشكر Si-Yi Zheng و Ying Lin و Qi Ke و Jun Song في مركز التدريس التجريبي للعلوم الطبية الأساسية في جامعة فوجيان الطبية على دعمهم. تم دعم هذه الدراسة من خلال المنح التالية: المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 82001608) ، مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة فوجيان ، الصين (رقم المنحة 2019J05071) ، مشروع التكنولوجيا الصحية بمقاطعة فوجيان (رقم المنحة 2018-1-69) ، صندوق بدء البحث العلمي ، جامعة فوجيان الطبية (رقم المنحة 2017XQ1001) ، مشروع تمويل بدء البحث العلمي للمواهب عالية المستوى بجامعة فوجيان الطبية (رقم المنحة XRCZX2017025) ومشروع البحث التعليم عبر الإنترنت وتدريس طلاب الدراسات العليا في الطب الصيني (رقم المنحة B-YXC20200202-06).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
References
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001 (2016).
- Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
- Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
- Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
- Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
- Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, 2953-2965 (2001).
- Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
- Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
- Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
- Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
- Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
- Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
- Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
- Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
- Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
- Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
- Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
- Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
- Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
- Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
- Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
- Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
- Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
- Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
- Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
- Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson’s Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
- Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
- Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Biologie du développement. 169 (2), 557-567 (1995).
- Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Biologie du développement. 205 (1), 49-64 (1999).
- Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
- Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
- Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
- Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).
