Denne artikkelen rapporterer en in vivo hemming av CENP-E gjennom abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon av GSK923295, en verdifull modell for mannlig meiotisk deling. Ved hjelp av immunfluorescens, flowcytometri og transmisjonselektronmikroskopianalyser viser vi at CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling og genominstabilitet i musespermatocytter.
I eukaryoter er meiose avgjørende for genomstabilitet og genetisk mangfold i seksuell reproduksjon. Eksperimentelle analyser av spermatocytter i testikler er avgjørende for undersøkelsene av spindelmontering og kromosomsegregering i mannlig meiotisk divisjon. Musespermatocytten er en ideell modell for mekanistiske studier av meiose, men de effektive metodene for analyse av spermatocytter mangler. I denne artikkelen rapporteres en praktisk og effektiv metode for in vivo-hemming av kinesin-7 CENP-E i spermatocytter fra mus. En detaljert prosedyre for testikkelinjeksjon av en spesifikk inhibitor GSK923295 gjennom abdominal kirurgi hos 3 uker gamle mus presenteres. Videre er beskrevet her en serie protokoller for vevsinnsamling og fiksering, hematoksylin-eosinfarging, immunfluorescens, flowcytometri og transmisjonselektronmikroskopi. Her presenterer vi en in vivo inhiberingsmodell via abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon, som kan være en kraftig teknikk for å studere mannlig meiose. Vi demonstrerer også at CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling og metafasestans i primære spermatocytter under meiose I. Vår in vivo inhiberingsmetode vil legge til rette for mekanistiske studier av meiose, tjene som en nyttig metode for genetiske modifikasjoner av mannlige kjønnslinjer, og kaste lys over fremtidige kliniske anvendelser.
Meiose er en av de viktigste, svært stive, evolusjonære konserverte hendelsene i eukaryote organismer, og er avgjørende for gametogenese, seksuell reproduksjon, genomintegritet og genetisk mangfold 1,2,3. Hos pattedyr gjennomgår kimcellene to påfølgende celledelinger, meiose I og II, etter en enkelt runde med DNA-replikasjon. I motsetning til søsterkromatider i mitose, parrer dupliserte homologe kromosomer seg og segregerer i to datterceller under meiose I 4,5. I meiose II trekker søsterkromatider fra hverandre og segregerer for å danne haploide kjønnsceller uten DNA-replikasjon6. Feil i en av de to meiotiske divisjonene, inkludert spindelmonteringsfeil og kromosomfeilsegregering, kan føre til tap av kjønnsceller, sterilitet eller aneuploidisyndromer 7,8,9.
Akkumulerende studier har vist at kinesinfamiliemotorer spiller en avgjørende rolle i reguleringen av kromosomjustering og segregering, spindelmontering, cytokinese og cellesyklusprogresjon i både mitotiske og meiotiske celler10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Centromere protein E) er en pluss-ende-rettet kinetochore motor som kreves for kromosomkongress, kromosomtransport og justering, og regulering av spindelmonteringskontrollpunkt i mitose 13,14,15,16,17,18. Under meiose fører CENP-E-hemming av den spesifikke inhibitoren GSK923295 til cellesyklusstans, kromosomfeiljustering, spindeldisorganisering og genominstabilitet i spermatogene celler19. Lokaliseringsmønstrene og dynamikken til CENP-E ved sentromerer av delende spermatocytter indikerer at CENP-E interagerer med kinetochoreproteiner for sekvensiell montering av sentromerer under meiose I20,21. I oocytter er CENP-E nødvendig for kromosomjustering og fullføring av meiose I13,22,23. Antistoffer eller morfolinoinjeksjon av CENP-E resulterer i feiljusterte kromosomer, unormal kinetochore orientering og meiose jeg arresterer i både mus og Drosophila oocytter23. Sammenlignet med de essensielle rollene til CENP-E i mitose, forblir funksjonene og mekanismene til CENP-E i meiose stort sett ukjente. Detaljerte mekanismer for CENP-E i kromosomkongress og genomstabilitet i mannlige meiotiske celler gjenstår å bli avklart.
Spermatogenese er en kompleks og langvarig fysiologisk prosess, som involverer sekvensiell spermatogonia-proliferasjon, meiose og spermiogenese. Derfor er hele prosessen usedvanlig vanskelig å reprodusere in vitro hos pattedyr og andre arter24,25. Det er umulig å indusere spermatocytter differensiering etter pachytenstadiet in vitro. Studier på mannlige meiotiske divisjoner har generelt vært begrenset til eksperimentelle analyser av tidlig meiotisk profase25,26. Til tross for mange teknologiske bestrebelser, inkludert kortsiktig kultur av spermatocytter27,28 og organkulturmetoder25, er det få effektive metoder for å studere mannlig meiotisk deling. Videre resulterer genetisk sletting av essensielle gener vanligvis i utviklingsstans og embryonal dødelighet. For eksempel klarer ikke museembryoer som mangler CENP-E å implantere og kan ikke utvikle tidligere implantasjon29, noe som er et hinder i mekanistiske studier av CENP-E i meiose. Samlet sett kan etablering av et praktisk og gjennomførbart system for å studere mannlig meiotisk divisjon i stor grad fremme forskningsfeltet meiose.
Den lille cellepermeable inhibitoren er et kraftig verktøy for å studere kinesinmotorer i celledeling og utviklingsprosesser. Den allosteriske inhibitoren, GSK923295, binder seg spesifikt til CENP-E motorisk domene, blokkerer frigivelsen av ADP (adenosindifosfat), og stabiliserer til slutt interaksjonene mellom CENP-E og mikrotubuli30. I denne studien presenteres en in vivo hemmingsmusemodell ved abdominalkirurgi og testikkelinjeksjon av GSK923295. CENP-E-hemming resulterer i kromosomfeilstilling i metafase I av primære spermatocytter. Videre fører CENP-E-hemming til meiotisk stans av spermatocytter og forstyrrelse av spermatogenese. En rekke protokoller er beskrevet for analyse av spermatocytter og kan brukes til å observere meiotiske spindelmikrotubuli, homologe kromosomer og subcellulære organeller i spermatocytter. Vår in vivo inhiberingsmetode er en effektiv metode for studier av meiotisk deling og spermatogenese.
I denne studien har vi etablert en in vivo CENP-E hemmingsmodell av musetestikler ved bruk av abdominalkirurgi og mikroinjeksjon av GSK923295. Abdominal kirurgi og testikulær injeksjonsmetode som brukes i denne studien har følgende fordeler. For det første er det ikke begrenset til musens alder. Eksperimenter kan utføre testikkelinjeksjon på et tidlig stadium, for eksempel hos 3 uker gamle eller yngre mus. For det andre har GSK923295 en spesifikk og utmerket hemmende effekt på CENP-E. For det tredje er den…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer av Cytoskeleton Laboratory ved Fujian Medical University for nyttige diskusjoner. Vi takker Jun-Jin Lin ved Public Technology Service Center, Fujian Medical University for teknisk assistanse innen flowcytometri. Vi takker Ming-Xia Wu og Lin-Ying Zhou ved Electron Microscopy Lab of Public Technology Service Center, Fujian Medical University for teknisk assistanse i elektronmikroskopi. Vi takker Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke, og Jun Song ved Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences ved Fujian Medical University for deres støtte. Denne studien ble støttet av følgende tilskudd: National Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, Kina (tilskuddsnummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (tilskuddsnummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (stipendnummer 2017XQ1001), Fujian Medical University høyt nivå talenter vitenskapelig forskning oppstartsfinansieringsprosjekt (tilskuddsnummer XRCZX2017025) og forskningsprosjekt av nettbasert utdanning og undervisning av studenter i kinesisk medisin (stipendnummer B-YXC20200202-06).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
DAPI | Beyotime | C1006 | |
Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
Leica ultramicrotome | Leica | ||
Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
Nail polish | Several commercial brands available | ||
Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |