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Biologie

Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

Published: December 28, 2021
doi:
10.3791/63271
, , , , , , ,
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital,Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

Este artículo informa una inhibición in vivo de CENP-E a través de cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295, un modelo valioso para la división meiótica masculina. Usando los ensayos de inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, mostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica e inestabilidad del genoma en espermatocitos de ratón.

Abstract

En eucariotas, la meiosis es esencial para la estabilidad del genoma y la diversidad genética en la reproducción sexual. Los análisis experimentales de los espermatocitos en los testículos son críticos para las investigaciones del ensamblaje del huso y la segregación cromosómica en la división meiótica masculina. El espermatocito de ratón es un modelo ideal para estudios mecanicistas de meiosis, sin embargo, faltan métodos efectivos para el análisis de espermatocitos. En este artículo, se informa un método práctico y eficiente para la inhibición in vivo de kinesina-7 CENP-E en espermatocitos de ratón. Se presenta un procedimiento detallado para la inyección testicular de un inhibidor específico GSK923295 a través de cirugía abdominal en ratones de 3 semanas de edad. Además, aquí se describen una serie de protocolos para la recolección y fijación de tejidos, tinción de hematoxilina-eosina, inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión. Aquí presentamos un modelo de inhibición in vivo mediante cirugía abdominal e inyección testicular, que podría ser una técnica potente para estudiar la meiosis masculina. También demostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica y detención en metafase en los espermatocitos primarios durante la meiosis I. Nuestro método de inhibición in vivo facilitará los estudios mecanicistas de la meiosis, servirá como un método útil para las modificaciones genéticas de las líneas germinales masculinas y arrojará luz sobre futuras aplicaciones clínicas.

Introduction

La meiosis es uno de los eventos más importantes, altamente rígidos y conservados evolutivamente en los organismos eucariotas, y es esencial para la gametogénesis, la reproducción sexual, la integridad del genoma y la diversidad genética 1,2,3. En los mamíferos, las células germinales experimentan dos divisiones celulares sucesivas, meiosis I y II, después de una sola ronda de replicación del ADN. A diferencia de las cromátidas hermanas en la mitosis, los cromosomas homólogos duplicados se emparejan y segregan en dos células hijas durante la meiosis I 4,5. En la meiosis II, las cromátidas hermanas se separan y segregan para formar gametos haploides sin replicación del ADN6. Los errores en cualquiera de las dos divisiones meióticas, incluyendo defectos de ensamblaje del huso y segregación cromosómica, pueden resultar en la pérdida de gametos, esterilidad o síndromes de aneuploidía 7,8,9.

Los estudios acumulados han demostrado que los motores de la familia de las quinesinas desempeñan un papel crucial en la regulación de la alineación y segregación cromosómica, el ensamblaje del huso, la citocinesis y la progresión del ciclo celular en células mitóticas y meióticas10,11,12. La quinesina-7 CENP-E (proteína Centromérica E) es un motor cinetocoro dirigido al extremo adicional requerido para el congreso cromosómico, el transporte y la alineación de cromosomas, y la regulación del punto de control del ensamblaje del huso en la mitosis 13,14,15,16,17,18. Durante la meiosis, la inhibición de CENP-E por el inhibidor específico GSK923295 conduce a la detención del ciclo celular, desalineación cromosómica, desorganización del huso e inestabilidad del genoma en células espermatogénicas19. Los patrones de localización y la dinámica de CENP-E en los centrómeros de los espermatocitos en división indican que CENP-E interactúa con las proteínas cinetocoros para el ensamblaje secuencial de centrómeros durante la meiosis I20,21. En ovocitos, CENP-E es necesario para la alineación cromosómica y la realización de la meiosis I13,22,23. La inyección de anticuerpos o morfolino de CENP-E da como resultado cromosomas desalineados, orientación anormal del cinetocoro y detención de la meiosis I tanto en ovocitos de ratón como de Drosophila 23. En comparación con las funciones esenciales de CENP-E en la mitosis, las funciones y mecanismos de CENP-E en la meiosis siguen siendo en gran parte desconocidos. Los mecanismos detallados de CENP-E en el congreso cromosómico y la estabilidad del genoma en células meióticas masculinas aún no se han aclarado.

La espermatogénesis es un proceso fisiológico complejo y duradero, que implica la proliferación secuencial de espermatogonias, la meiosis y la espermiogénesis. Por lo tanto, todo el proceso es extraordinariamente difícil de reproducir in vitro en mamíferos y otras especies24,25. Es imposible inducir la diferenciación de los espermatocitos después de la etapa de paquiteno in vitro. Los estudios sobre las divisiones meióticas masculinas se han limitado generalmente a análisis experimentales de la profase meiótica temprana25,26. A pesar de muchos esfuerzos tecnológicos, incluyendo el cultivo a corto plazo de espermatocitos27,28 y los métodos de cultivo de órganos25, existen pocos métodos efectivos para estudiar la división meiótica masculina. Además, la eliminación genética de genes esenciales generalmente resulta en una detención del desarrollo y letalidad embrionaria. Por ejemplo, los embriones de ratón que carecen de CENP-E no se implantan y no pueden desarrollarse más allá de la implantación29, lo que es un obstáculo en los estudios mecanicistas de CENP-E en la meiosis. En conjunto, el establecimiento de un sistema práctico y factible para estudiar la división meiótica masculina puede promover en gran medida el campo de investigación de la meiosis.

El inhibidor permeable a las células pequeñas es una herramienta poderosa para estudiar los motores de quinesina en la división celular y los procesos de desarrollo. El inhibidor alostérico, GSK923295, se une específicamente al dominio motor CENP-E, bloquea la liberación de ADP (difosfato de adenosina) y finalmente estabiliza las interacciones entre CENP-E y los microtúbulos30. En este estudio, se presenta un modelo de ratón de inhibición in vivo mediante cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295. La inhibición de CENP-E da lugar a una desalineación cromosómica en la metafase I de los espermatocitos primarios. Además, la inhibición de CENP-E conduce a la detención meiótica de los espermatocitos y la interrupción de la espermatogénesis. Se describen una serie de protocolos para el análisis de espermatocitos y se pueden aplicar para observar microtúbulos fusiformes meióticos, cromosomas homólogos y orgánulos subcelulares en espermatocitos. Nuestro método de inhibición in vivo es un método eficaz para los estudios de división meiótica y espermatogénesis.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Fujian (número de protocolo SYXK 2016-0007). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las directrices pertinentes del Cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (publicaciones de los NIH número 8023, revisadas en 1978). 1. Construcción de modelos de ratón de inhibición de CENP-E mediados p…

Representative Results

Hemos construido con éxito un modelo de inhibición in vivo de CENP-E de testículos de ratón mediante cirugía abdominal e inyección testicular de GSK92329519. Los pasos técnicos clave de este método se muestran en la Figura 1. Después de la inyección testicular de GSK923295 durante 4 días, los testículos se cosecharon para análisis adicionales. En el grupo control, la onda espermatogénica en los túbulos seminíferos fue regular y organizada (<st…

Discussion

En este estudio, hemos establecido un modelo de inhibición in vivo de CENP-E de testículos de ratón utilizando la cirugía abdominal y la microinyección de GSK923295. La cirugía abdominal y el método de inyección testicular utilizados en este estudio tienen las siguientes ventajas. En primer lugar, no se limita a la edad de los ratones. Los experimentadores pueden realizar la inyección testicular en una etapa temprana, por ejemplo, en ratones de 3 semanas o más jóvenes. En segundo lugar, GSK923295 tien…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio de Citoesqueleto de la Universidad Médica de Fujian por sus útiles discusiones. Agradecemos a Jun-Jin Lin en el Centro de Servicios de Tecnología Pública de la Universidad Médica de Fujian por su asistencia técnica en citometría de flujo. Agradecemos a Ming-Xia Wu y Lin-Ying Zhou del Laboratorio de Microscopía Electrónica del Centro de Servicios de Tecnología Pública de la Universidad Médica de Fujian por su asistencia técnica en microscopía electrónica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke y Jun Song en el Centro de Enseñanza Experimental de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad Médica de Fujian por su apoyo. Este estudio fue apoyado por las siguientes subvenciones: Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de subvención 82001608), Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Fujian, China (número de subvención 2019J05071), Proyecto de Tecnología de Salud Provincial de Fujian (número de subvención 2018-1-69), Fondo de inicio para la investigación científica, Universidad Médica de Fujian (número de subvención 2017XQ1001), Proyecto de financiación de la investigación científica de talentos de alto nivel de la Universidad Médica de Fujian (número de subvención XRCZX2017025) y Proyecto de investigación de educación en línea y enseñanza de estudiantes graduados de medicina china (número de beca B-YXC20200202-06).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde – aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418
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References

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Xu, M., Yang, Y., Wei, Y., Zhang, J., Lin, X., Lin, X., Chen, H., She, Z. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).
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