طريقة كهربية فعالة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة مسارات الإشارات الأولية المعتمدة على السيليوم في سلائف الخلايا الحبيبية
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا كهربائيا قابلا للتكرار في المختبر للتلاعب الجيني بسلائف الخلايا الحبيبية المخيخية الأولية (GCPs) وهو فعال من حيث التكلفة وفعال وقابل للحياة. علاوة على ذلك ، يوضح هذا البروتوكول أيضا طريقة مباشرة للدراسة الجزيئية لمسارات إشارات القنفذ الأولية المعتمدة على السيليوم في خلايا GCP الأولية.
Abstract
السيليوم الأولي هو عضية إشارات حرجة موجودة في كل خلية تقريبا تنقل محفزات إشارات القنفذ (Hh) من سطح الخلية. في سلائف الخلايا الحبيبية (GCP) ، يعمل السيليوم الأولي كمركز إشارات محوري ينظم تكاثر خلايا السلائف عن طريق تعديل مسار إشارات Hh. يتم تسهيل التحقيق في آلية إشارات Hh الأولية المعتمدة على السيليوم من خلال التلاعب الجيني في المختبر لمكونات المسار لتصور توطينها الديناميكي إلى السيليوم الأولي. ومع ذلك ، فإن نقل الجينات المحورة في الثقافات الأولية ل GCPs باستخدام طرق electroporation المعروفة حاليا مكلف بشكل عام وغالبا ما يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا وكفاءة النقل غير المرغوب فيها. تقدم هذه الورقة بروتوكولا كهربائيا فعالا وفعالا من حيث التكلفة وبسيطا يوضح كفاءة نقل عالية تبلغ ~ 80-90٪ وجدوى الخلية المثلى. هذه طريقة تعديل وراثي بسيطة وقابلة للتكرار وفعالة تنطبق على دراسة مسار إشارات القنفذ الأولي المعتمد على السيليوم في مزارع GCP الأولية.
Introduction
تستخدم GCPs المخيخية على نطاق واسع لدراسة آلية مسار إشارات Hh في أنواع الخلايا السلفية العصبية بسبب وفرتها العالية وحساسيتها العالية لمسار إشارات Hh في الجسم الحي1,2,3,4. في GCPs ، يعمل السيليوم الأولي كمركز محوري لنقل إشارة Hh5 الذي ينظم تكاثر خلايا السلائف6,7,8. غالبا ما يكون التصور المختبري لمكونات إشارات Hh على السيليوم الأساسي أمرا صعبا بسبب انخفاض مستوياتها القاعدية الذاتية. وبالتالي ، فإن تعديل الجينات المحورة لمستويات التعبير عن البروتين ووضع علامات الفلوروفور على الجين محل الاهتمام هي طرق مفيدة لدراسة المسار بدقة جزيئية. ومع ذلك، فإن التلاعب الجيني بالمزارع الأولية لبرنامج GCP باستخدام نهج النقل القائمة على الجسيمات الشحمية غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل، مما يعوق إجراء المزيد من التحقيقات الجزيئية9. يزيد التفريغ الكهربائي من الكفاءة ولكنه يتطلب عادة كواشف كهربائية باهظة خاصة بالبائع ومقيدة بنوع الخلية10.
تقدم هذه الورقة طريقة كهربية عالية الكفاءة وفعالة من حيث التكلفة لمعالجة مكونات مسار إشارات Hh في الثقافات الأولية ل GCP. باستخدام بروتوكول الإلكتروبوراتيون المعدل هذا، تم تسليم بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم بالجين المتحول السلس (pEGFP-Smo) بكفاءة إلى GCPs وحقق معدلات عالية من بقاء الخلايا ونقلها (80-90٪). وعلاوة على ذلك، وكما يتضح من التلطيخ الكيميائي المناعي، أظهرت GCPs المنقولة حساسية عالية للتنشيط الناجم عن الناهض السلس لمسار إشارات Hh عن طريق الاتجار ب EGFP-Smo إلى الأهداب الأولية. يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق بشكل مباشر ومفيدا للتجارب التي تنطوي في المختبر على تعديل جيني لأنواع الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل مزارع الخلايا الأولية البشرية والقوارض ، وكذلك الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
عادة ما يرتبط نقل الجينات المحورة في ثقافة GCP الأولية عن طريق طريقة electroporation بانخفاض صلاحية الخلايا وضعف كفاءة النقل9,10. تقدم هذه الورقة بروتوكولا كهربائيا فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتكرار أظهر كفاءة عالية وقابلية للتطبيق. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض أيضا طر?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل صندوق HKBU التأسيسي ومنحة بدء التشغيل من المستوى 2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009) ، ومجلس المنح البحثية – صندوق البحوث التعاونية (CRF-C2103-20GF) إلى C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Biologie du développement. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Biologie du développement. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
