Effektiv og omkostningseffektiv elektroporeringsmetode til undersøgelse af primære ciliumafhængige signalveje i granulecelleprækursoren
Summary
Her præsenterer vi en reproducerbar in vitro elektroporering protokol for genetisk manipulation af primære cerebellar granulat celle prækursorer (GCPs), der er omkostningseffektiv, effektiv og levedygtig. Desuden viser denne protokol også en enkel metode til molekylær undersøgelse af primære ciliumafhængige pindsvinssignaleringsveje i primære GCP-celler.
Abstract
Den primære cilium er en kritisk signalering organelle findes på næsten hver celle, transduces Hedgehog (Hh) signalering stimuli fra celleoverfladen. I granulecelleprækursoren (GCP) fungerer det primære cilium som et centralt signalcenter, der orkestrerer forløbercellespredning ved at modulere Hh-signalvejen. Undersøgelsen af primære cilium-afhængige Hh signalering maskiner lettes ved in vitro genetisk manipulation af stien komponenter til at visualisere deres dynamiske lokalisering til den primære cilium. Imidlertid er transfection af transgener i de primære kulturer af praktiserende læger ved hjælp af de aktuelt kendte elektroporeringsmetoder generelt dyrt og resulterer ofte i lav celle levedygtighed og uønsket transfection effektivitet. Dette papir introducerer en effektiv, omkostningseffektiv og enkel elektroporeringsprotokol, der demonstrerer en høj transfection effektivitet på ~ 80-90% og optimal celle levedygtighed. Dette er en enkel, reproducerbar og effektiv genetisk modifikationsmetode, der gælder for studiet af den primære ciliumafhængige pindsvinsignaleringsvej i primære GCP-kulturer.
Introduction
Cerebellar praktiserende læger er meget udbredt til at studere maskiner af Hh signalering vej i neuronal stamfader celle-typer på grund af deres høje overflod og høj følsomhed over for Hh signalering vej i vivo1,2,3,4. I praktiserende læger fungerer det primære cilium som et afgørende Hh-signaltransduktionshub5, der orkestrerer spredningen af forstadiecellerne6,7,8. In vitro visualisering af Hh signalering komponenter på den primære cilium er ofte udfordrende på grund af deres lave endogene basale niveauer. Derfor er transgene modifikation af proteinekspressionsniveauer og fluorophoremærkning af det interessegen nyttige tilgange til at studere vejen ved molekylær opløsning. Men genmanipulation af GCP primære kulturer ved hjælp af liposom-baserede transfection tilgange ofte resultere i lav transfection effektivitet, hindrer yderligere molekylære undersøgelser9. Elektroporation øger effektiviteten, men kræver normalt ublu leverandørspecifikke og celletypebegrænsede elektroporeringsreagenser10.
Dette papir introducerer en højeffektiv og omkostningseffektiv elektroporeringsmetode til at manipulere Hh-signalvejskomponenterne i GCP-primære kulturer. Ved hjælp af denne modificerede elektroporeringsprotokol blev et grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket Glattet transgen (pEGFP-Smo) effektivt leveret til GCPs og opnåede høj celleoverlevelse og transfekturerate (80-90%). Desuden viste de transfekterede praktiserende læger, som det fremgår af den immunocytokemiske farvning, høj følsomhed over for udglattet agonistisk induceret aktivering af Hh-signalvejen ved at smugle EGFP-Smo til den primære cilier. Denne protokol skal være direkte anvendelig og gavnlig for forsøg, der involverer in vitro genetisk modifikation af celletyper, der er vanskelige at transfekte, såsom primære cellekulturer for mennesker og gnavere samt menneskeskabte pluripotente stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transfection af transgener i primær GCP kultur ved elektroporation metode er typisk forbundet med lav celle levedygtighed og dårlig transfection effektivitet9,10. Dette papir introducerer en omkostningseffektiv og reproducerbar elektroporering protokol, der har vist høj effektivitet og levedygtighed. Derudover demonstrerer vi også en enkel metode til at studere den primære ciliumafhængige Hh-signalvej i primære GCP-celler.
Andre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af HKBU Seed Fund og Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) til C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Biologie du développement. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Biologie du développement. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
