ग्रेन्युल सेल अग्रदूत में प्राथमिक सिलियम-निर्भर सिग्नलिंग मार्गों का अध्ययन करने के लिए कुशल और लागत प्रभावी इलेक्ट्रोपोरेशन विधि
Summary
यहां, हम प्राथमिक अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल सेल अग्रदूतों (जीसीपी) के आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक पुनरुत्पादक इन विट्रो इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो लागत प्रभावी, कुशल और व्यवहार्य है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल प्राथमिक जीसीपी कोशिकाओं में प्राथमिक सिलियम-निर्भर हेजहोग सिग्नलिंग मार्गों के आणविक अध्ययन के लिए एक सीधी विधि भी प्रदर्शित करता है।
Abstract
प्राथमिक सिलियम एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग ऑर्गेनेल है जो लगभग हर सेल पर पाया जाता है जो हेजहोग (एचएच) को सेल की सतह से सिग्नलिंग उत्तेजनाओं को ट्रांसड्यूस करता है। ग्रेन्युल सेल अग्रदूत (जीसीपी) में, प्राथमिक सिलियम एक निर्णायक सिग्नलिंग केंद्र के रूप में कार्य करता है जो एचएच सिग्नलिंग मार्ग को संशोधित करके अग्रदूत सेल प्रसार को ऑर्केस्ट्रेट करता है। प्राथमिक सिलियम-निर्भर एचएच सिग्नलिंग मशीनरी की जांच को प्राथमिक सिलियम में उनके गतिशील स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए मार्ग घटकों के इन विट्रो आनुवंशिक हेरफेर द्वारा सुविधाजनक बनाया जाता है। हालांकि, वर्तमान में ज्ञात इलेक्ट्रोपोरेशन विधियों का उपयोग करके जीसीपी की प्राथमिक संस्कृतियों में ट्रांसजीन का अभिकर्मक आमतौर पर महंगा होता है और अक्सर कम सेल व्यवहार्यता और अवांछनीय अभिकर्मक दक्षता में परिणाम होता है। यह पेपर एक कुशल, लागत प्रभावी और सरल इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल का परिचय देता है जो ~ 80-90% और इष्टतम सेल व्यवहार्यता की एक उच्च अभिकर्मक दक्षता को दर्शाता है। यह एक सरल, पुनरुत्पादक और कुशल आनुवंशिक संशोधन विधि है जो प्राथमिक जीसीपी संस्कृतियों में प्राथमिक सिलियम-निर्भर हेजहोग सिग्नलिंग मार्ग के अध्ययन पर लागू होती है।
Introduction
सेरेबेलर जीसीपी का व्यापक रूप से न्यूरोनल पूर्वज सेल-प्रकारों में एचएच सिग्नलिंग मार्ग की मशीनरी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि विवो 1,2,3,4 में एचएच सिग्नलिंग मार्ग के लिए उनकी उच्च बहुतायत और उच्च संवेदनशीलता के कारण। जीसीपी में, प्राथमिक सिलियम एक निर्णायक एचएच सिग्नल ट्रांसडक्शन हब 5 के रूप में कार्य करता है जो अग्रदूत कोशिकाओं के प्रसार को व्यवस्थित करता है6,7,8। प्राथमिक सिलियम पर एचएच सिग्नलिंग घटकों का इन विट्रो विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर उनके कम अंतर्जात बेसल स्तरों के कारण चुनौतीपूर्ण होता है। इसलिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का ट्रांसजीन संशोधन और ब्याज के जीन के फ्लोरोफोर टैगिंग आणविक संकल्प पर मार्ग का अध्ययन करने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण हैं। हालांकि, लिपोसोम-आधारित अभिकर्मक दृष्टिकोण का उपयोग करके जीसीपी प्राथमिक संस्कृतियों के आनुवंशिक हेरफेर के परिणामस्वरूप अक्सर कम अभिकर्मक दक्षता होती है, जो आगे आणविक जांच में बाधा डालती है। Electroporation दक्षता बढ़ाता है, लेकिन आमतौर पर अत्यधिक विक्रेता-विशिष्ट और सेल प्रकार-प्रतिबंधित electroporation अभिकर्मकों 10 की आवश्यकता होती है।
यह पेपर जीसीपी प्राथमिक संस्कृतियों में एचएच सिग्नलिंग मार्ग घटकों में हेरफेर करने के लिए एक उच्च दक्षता और लागत प्रभावी इलेक्ट्रोपोरेशन विधि का परिचय देता है। इस संशोधित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एक हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) – टैग किए गए स्मूडेन्ड ट्रांसजीन (पीईजीएफपी-एसएमओ) को कुशलतापूर्वक जीसीपी को वितरित किया गया था और उच्च सेल अस्तित्व और अभिकर्मक दर (80-90%) प्राप्त की गई थी। इसके अलावा, जैसा कि immunocytochemical धुंधला द्वारा प्रमाणित है, transfected जीसीपी प्राथमिक सिलिया के लिए EGFP-Smo तस्करी द्वारा Hh सिग्नलिंग मार्ग के Smoothened एगोनिस्ट-प्रेरित सक्रियण के लिए उच्च संवेदनशीलता दिखाया। यह प्रोटोकॉल सीधे लागू होगा और उन प्रयोगों के लिए फायदेमंद होगा जो सेल प्रकारों के इन विट्रो आनुवंशिक संशोधन को शामिल करते हैं, जिन्हें ट्रांसफेक्ट करना मुश्किल होता है, जैसे कि मानव और कृंतक प्राथमिक सेल संस्कृतियों के साथ-साथ मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इलेक्ट्रोपोरेशन विधि द्वारा प्राथमिक जीसीपी संस्कृति में ट्रांसजीन का अभिकर्मक आमतौर पर कम सेल व्यवहार्यता और खराब अभिकर्मक दक्षता 9,10 से जुड़ा होता है। यह पेपर एक लागत प्रभावी…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को एचकेबीयू बीज निधि और टियर -2 स्टार्ट-अप अनुदान (आरजी-एसजीटी 2 / 18-19 / एससीआई / 009), अनुसंधान अनुदान परिषद-सहयोगी अनुसंधान कोष (सीआरएफ-सी 2103-20जीएफ) द्वारा सीएचएच होर को समर्थित किया गया था।
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
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