顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法
Summary
ここでは、費用対効果が高く、効率的で実行可能な一次小脳顆粒細胞前駆体(GCP)の遺伝子操作のための再現性のある インビトロ エレクトロポレーションプロトコルを提示する。さらに、このプロトコルはまた、一次GCP細胞における一次シリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の分子的研究のための簡単な方法を示す。
Abstract
一次シリウムは、ヘッジホッグ(Hh)シグナル伝達刺激を細胞表面から伝達するほぼすべての細胞に見られる重要なシグナル伝達オルガネラである。顆粒細胞前駆体(GCP)において、一次シリウムはHhシグナル伝達経路を調節することによって前駆細胞増殖を調整する極めて重要なシグナル伝達センターとして機能する。一次シリウム依存性Hhシグナル伝達機械の調査は、経路成分の インビトロ 遺伝子操作によって促進され、一次シリウムへの動的局在化を可視化する。しかし、現在知られているエレクトロポレーション法を用いたGCPの一次培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、一般にコストがかかり、しばしば低い細胞生存率および望ましくないトランスフェクション効率をもたらす。この論文では、高いトランスフェクション効率が80~90%、最適な細胞生存率を実証する、効率的で費用対効果の高いシンプルなエレクトロポレーションプロトコルを紹介します。これは、一次GCP培養における主要なシリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の研究に適用可能な、単純で再現性のある効率的な遺伝子改変方法である。
Introduction
小脳GCPは、生体内のHhシグナル伝達経路に対する高い存在量と高感度性のために、ニューロン前駆細胞型におけるHhシグナル伝達経路の機械を研究するために広く使用されています。GCPにおいて、一次シリウムは、前駆細胞6,7,8の増殖を調整する極めて重要なHhシグナル伝達ハブ5として機能する。一次シリウム上のHhシグナル伝達成分のインビジュアライゼーションは、内因性の基底レベルが低いため、しばしば困難です。したがって、目的の遺伝子のタンパク質発現レベルおよびフルオロフォアタグ付けの遺伝子導入修飾は、分子分解能で経路を研究するのに有用なアプローチである。しかし、リポソームベースのトランスフェクションアプローチを用いたGCP一次培養の遺伝子操作は、トランスフェクション効率が低いことが多く、さらなる分子調査を妨げる9。エレクトロポレーションは効率を高めるが、一般的には法外なベンダー固有および細胞型制限型エレクトロポレーション試薬10を必要とする。
本論文では、GCP一次培養におけるHhシグナル伝達経路成分を操作するための高効率かつ費用対効果の高いエレクトロポレーション法を紹介する。この改変エレクトロポレーションプロトコルを用いて、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きスムージングトランスジーン(pEGFP-Smo)をGCPに効率よく送達し、高い細胞生存率とトランスフェクション率(80~90%)を達成しました。さらに、免疫細胞化学的染色によって証明されるように、トランスフェクトGCPは、EGFP-Smoをプライマリ繊毛に密売することによってHhシグナル伝達経路のSmoothedアゴニスト誘発活性化に対して高い感受性を示した。このプロトコルは、ヒトおよびげっ歯類の一次細胞培養、ならびにヒト人工多能性幹細胞など、トランスフェクトが困難な細胞型の インビトロ 遺伝子改変を伴う実験に対して直接的に適用され、有益である。
Protocol
Representative Results
Discussion
エレクトロポレーション法による原発GCP培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、典型的には低い細胞生存率と低いトランスフェクション効率9,10と関連している。この論文では、高効率と生存率を実証した、費用対効果が高く、再現性の高いエレクトロポレーションプロトコルを紹介する。また、一次GCP細胞における一次シリウ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、HKBUシードファンドとティア2スタートアップグラント(RG-SGT2/18-19/SCI/009)、研究助成金協議会共同研究基金(CRF-C2103-20GF)からC.H.H.Horに支援されました。
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
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