Effektiv og kostnadseffektiv elektroporasjonsmetode for å studere primære ciliumavhengige signalveier i granulcelleforløperen
Summary
Her presenterer vi en reproduserbar de vitro-elektroporasjonsprotokoll for genetisk manipulering av primære cerebellar granulatcelleforløpere (GCPer) som er kostnadseffektive, effektive og levedyktige. Videre demonstrerer denne protokollen også en enkel metode for molekylær studie av primære ciliumavhengige Hedgehog-signalveier i primære GCP-celler.
Abstract
Det primære ciliumet er en kritisk signalorganell som finnes på nesten alle celler som transduserer pinnsvin (Hh) som signaliserer stimuli fra celleoverflaten. I granulatcellens forløper (GCP) fungerer det primære ciliumet som et pivotalt signalsenter som orkestrerer forløpercelleproliferasjon ved å modulere Hh-signalveien. Undersøkelsen av primære cilium-avhengige Hh-signalmaskiner forenkles ved in vitro genetisk manipulering av banekomponentene for å visualisere deres dynamiske lokalisering til det primære ciliumet. Imidlertid er transfeksjon av transgenes i primærkulturene til fastleger ved hjelp av de kjente elektroporasjonsmetodene generelt kostbart og resulterer ofte i lav celle levedyktighet og uønsket transfeksjonseffektivitet. Dette dokumentet introduserer en effektiv, kostnadseffektiv og enkel elektroporasjonsprotokoll som demonstrerer en høy transfeksjonseffektivitet på ~ 80-90% og optimal celle levedyktighet. Dette er en enkel, reproduserbar og effektiv genetisk modifikasjonsmetode som gjelder for studiet av den primære ciliumavhengige Hedgehog-signalveien i primære GCP-kulturer.
Introduction
Cerebellar GCPs er mye brukt til å studere maskineriet til Hh-signalveien i nevronale stamcelletyper på grunn av deres høye overflod og høye følsomhet for Hh-signalveien i vivo1,2,3,4. I fastleger fungerer det primære ciliumet som et sentralt Hh-signaltransduksjonssenter5 som orkestrerer spredningen av forløpercellene6,7,8. In vitro visualisering av Hh-signalkomponenter på det primære ciliumet er ofte utfordrende på grunn av deres lave endogene basale nivåer. Derfor er transgene modifikasjon av proteinuttrykksnivåer og fluoroformerking av genet av interesse nyttige tilnærminger for å studere banen ved molekylær oppløsning. Imidlertid resulterer genetisk manipulering av GCP primærkulturer ved hjelp av liposombaserte transfeksjonsmetoder ofte i lav transfeksjonseffektivitet, noe som hindrer ytterligere molekylære undersøkelser9. Elektroporasjon øker effektiviteten, men krever vanligvis ublu leverandørspesifikke og celletypebegrensede elektroporasjonsreagenser10.
Dette dokumentet introduserer en høyeffektiv og kostnadseffektiv elektroporasjonsmetode for å manipulere Hh-signalveikomponentene i GCP primære kulturer. Ved hjelp av denne modifiserte elektroporasjonsprotokollen ble et grønt fluorescerende protein (GFP)-merket Smoothened transgene (pEGFP-Smo) effektivt levert til GCPer og oppnådde høy celleoverlevelse og transfeksjonshastigheter (80-90%). Videre, som det fremgår av immunocytokjemisk farging, viste de transfekterte fastlegene høy følsomhet for glattet agonistindusert aktivering av Hh-signalveien ved å smugle EGFP-Smo til det primære cilia. Denne protokollen skal være direkte anvendelig og gunstig for eksperimenter som involverer in vitro genetisk modifikasjon av celletyper som er vanskelige å transfektere, for eksempel menneskelige og gnagere primærcellekulturer, samt menneskeskapte pluripotente stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transfeksjon av transgenes i primær GCP-kultur ved elektroporasjonsmetode er vanligvis forbundet med lav celle levedyktighet og dårlig transfeksjonseffektivitet9,10. Dette dokumentet introduserer en kostnadseffektiv og reproduserbar elektroporasjonsprotokoll som har vist høy effektivitet og levedyktighet. I tillegg viser vi også en enkel metode for å studere den primære ciliumavhengige Hh-signalveien i primære GCP-celler.
Andre …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av HKBU Seed Fund og Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) til C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Biologie du développement. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Biologie du développement. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
