Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.
Abstract
O cílio primário é uma organela de sinalização crítica encontrada em quase todas as células que transduzem os estímulos de sinalização de Hedgehog (HH) da superfície celular. No precursor da célula de grânulo (GCP), o cílio primário atua como um centro de sinalização crucial que orquestra a proliferação de células precursoras modulando a via de sinalização HH. A investigação do maquinário de sinalização HH, dependente do cítio primário, é facilitada pela manipulação genética in vitro dos componentes da via para visualizar sua localização dinâmica para o círio primário. No entanto, a transfecção de transgenes nas culturas primárias dos GCPs usando os métodos de eletroporação atualmente conhecidos é geralmente cara e muitas vezes resulta em baixa viabilidade celular e eficiência de transfecção indesejável. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação eficiente, econômico e simples que demonstra uma alta eficiência de transfecção de ~80-90% e a viabilidade celular ideal. Trata-se de um método de modificação genética simples, reprodutível e eficiente que é aplicável ao estudo da via de sinalização de Ouriço dependente do cilium primário nas culturas primárias do GCP.
Introduction
Os GCPs cerebelares são amplamente utilizados para estudar o maquinário da via de sinalização HH em tipos de células progenitoras neuronais devido à sua alta abundância e alta sensibilidade à via de sinalização HH em vivo1,2,3,4. Em GCPs, o cílio primário atua como um hub de transdução de sinal HH crucial5 que orquestra a proliferação das células precursoras6,7,8. A visualização in vitro de componentes de sinalização de HH no cílio primário é muitas vezes desafiadora devido aos seus baixos níveis basais endógenos. Assim, a modificação transgênica dos níveis de expressão proteica e a marcação fluorófora do gene de interesse são abordagens úteis para estudar o caminho na resolução molecular. No entanto, a manipulação genética das culturas primárias do GCP usando abordagens de transfecção baseadas em liposome muitas vezes resultam em baixa eficiência de transfecção, dificultando novas investigações moleculares9. A eletroporação aumenta a eficiência, mas geralmente requer reagentes de eletroporação exorbitantes específicos do fornecedor e restritos ao tipo celular10.
Este artigo introduz um método de eletroporação de alta eficiência e custo-benefício para manipular os componentes da via de sinalização HH nas culturas primárias GCP. Usando este protocolo de eletroporação modificado, um transgene smoothened smoothened (pEGFP-Smo) com marca verde foi fornecido eficientemente aos GCPs e alcançou altas taxas de sobrevivência celular e transfecção (80-90%). Além disso, como evidenciado pela coloração imunocitômica, os GCPs transfectados mostraram alta sensibilidade à ativação agonista induzida pelo HH pelo tráfico de EGFP-Smo para a cília primária. Este protocolo deve ser diretamente aplicável e benéfico para experimentos que envolvem modificação genética in vitro de tipos celulares difíceis de transfetar, como culturas de células primárias humanas e roedores, bem como células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem.
Protocol
Representative Results
Discussion
A transfecção de transgenes na cultura GCP primária pelo método de eletroporação é tipicamente associada à baixa viabilidade celular e à baixa eficiência de transfecção9,10. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação econômico e reprodutível que demonstrou alta eficiência e viabilidade. Além disso, também demonstramos um método simples de estudar a via de sinalização HH dependente do círio primário nas células GCP primárias.
…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo HKBU Seed Fund e Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) para C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
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