Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки
Summary
Здесь мы представляем воспроизводимый протокол электропорации in vitro для генетических манипуляций с первичными предшественниками клеток гранул мозжечка (GCP), который является экономически эффективным, эффективным и жизнеспособным. Кроме того, этот протокол также демонстрирует простой метод молекулярного исследования первичных реснечно-зависимых сигнальных путей Hedgehog в первичных клетках GCP.
Abstract
Первичная ресничка является критической сигнальной органеллой, обнаруженной почти на каждой клетке, которая преобразует сигнальные стимулы Hedgehog (Hh) с поверхности клетки. В предшественнике гранулярной клетки (GCP) первичная ресничка действует как ключевой сигнальный центр, который организует пролиферацию клеток-предшественников, модулируя сигнальный путь Hh. Исследование первичного ресничково-зависимого сигнального механизма Hh облегчается генетическими манипуляциями in vitro с компонентами пути для визуализации их динамической локализации в первичной ресничке. Однако трансфекция трансгенов в первичных культурах ГКП с использованием известных в настоящее время методов электропорации, как правило, является дорогостоящей и часто приводит к низкой жизнеспособности клеток и нежелательной эффективности трансфекции. В этой статье представлен эффективный, экономичный и простой протокол электропорации, который демонстрирует высокую эффективность трансфекции ~ 80-90% и оптимальную жизнеспособность ячейки. Это простой, воспроизводимый и эффективный метод генетической модификации, который применим к изучению первичного ресничковозависимого сигнального пути ежа в первичных культурах GCP.
Introduction
Мозжечковые GCP широко используются для изучения механизма сигнального пути Hh в нейронных типах клеток-предшественников из-за их высокой распространенности и высокой чувствительности к сигнальному пути Hh de vivo1,2,3,4. В GCP первичная ресничка действует как ключевой сигнальный узел трансдукции Hh5, который управляет пролиферацией клеток-предшественников6,7,8. Визуализация in vitro сигнальных компонентов Hh на первичной ресничке часто является сложной задачей из-за их низких эндогенных базальных уровней. Следовательно, трансгенная модификация уровней экспрессии белка и флуорофорная маркировка интересующего гена являются полезными подходами к изучению пути с молекулярным разрешением. Однако генетическое манипулирование первичными культурами GCP с использованием подходов к трансфекции на основе липосом часто приводит к низкой эффективности трансфекции, препятствуя дальнейшим молекулярным исследованиям9. Электропорация повышает эффективность, но обычно требует непомерных электропорационных реагентов, специфичных для конкретного производителя и ограниченных по типу ячейки10.
В данной работе представлен высокоэффективный и экономически эффективный метод электропорации для манипулирования компонентами сигнального пути Hh в первичных культурах GCP. Используя этот модифицированный протокол электропорации, зеленый флуоресцентный белок (GFP), помеченный сглаженным трансгеном (pEGFP-Smo), был эффективно доставлен в GCP и достиг высокой выживаемости клеток и скорости трансфекции (80-90%). Кроме того, как свидетельствует иммуноцитохимическое окрашивание, трансфектированные GCP показали высокую чувствительность к сглаженной агонист-индуцированной активации сигнального пути Hh путем транспортировки EGFP-Smo в первичные реснички. Этот протокол должен быть непосредственно применим и полезен для экспериментов, которые включают генетическую модификацию in vitro типов клеток, которые трудно трансфектировать, таких как культуры первичных клеток человека и грызунов, а также индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Трансфекция трансгенов в первичной культуре GCP методом электропорации обычно связана с низкой жизнеспособностью клеток и плохой эффективностью трансфекции9,10. В настоящем документе представлен экономически эффективный и воспроизводимый протокол элек…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Посевным фондом HKBU и грантом tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Советом по исследовательским грантам-Фондом совместных исследований (CRF-C2103-20GF) для C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Biologie du développement. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Biologie du développement. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
