Effektiv och kostnadseffektiv elektroporationsmetod för att studera primära ciliumberoende signalvägar i granulatcellprekursoren
Summary
Här presenterar vi ett reproducerbart in vitro elektroporation protokoll för genetisk manipulation av primära cerebellar granulat cell prekursorer (GCPs) som är kostnadseffektiva, effektiva och livskraftiga. Dessutom visar detta protokoll också en enkel metod för molekylär studie av primära cilium-beroende Hedgehog signalering vägar i primära GCP celler.
Abstract
Det primära ciliumet är en kritisk signalerande organell som finns på nästan varje cell som omvandlar igelkott (Hh) signalerar stimuli från cellytan. I granulatcellprekursoren (GCP) fungerar det primära ciliumet som ett pivotalt signalcenter som orkestrerar prekursorcellproliferation genom att modulera Hh-signalvägen. Undersökningen av primära cilium-beroende Hh signalering maskiner underlättas av in vitro genetisk manipulation av utbildningsavsnittet komponenter att visualisera deras dynamiska lokalisering till det primära cilium. Transfection av transgenes i de primära kulturerna av GCPs med hjälp av de för närvarande kända elektroporationsmetoderna är dock i allmänhet kostsamt och resulterar ofta i låg cell livskraft och oönskad transfektion effektivitet. Detta dokument introducerar ett effektivt, kostnadseffektivt och enkelt elektroporationsprotokoll som visar en hög transfekteringseffektivitet på ~ 80-90% och optimal cellviabilitet. Detta är en enkel, reproducerbar och effektiv genetisk modifieringsmetod som är tillämplig på studien av den primära ciliumberoende Hedgehog-signalvägen i primära GCP-kulturer.
Introduction
Cerebellar GCPs används ofta för att studera maskiner i Hh-signalvägen i neuronala stamceller på grund av deras höga överflöd och höga känslighet för Hh-signalvägen de vivo1,2,3,4. I GCPs fungerar det primära ciliumet som ett pivotalT Hh-signaltransduktionsnav5 som orkestrerar spridningen av prekursorcellerna6,7,8. In vitro visualisering av Hh signalering komponenter på det primära cilium är ofta utmanande på grund av deras låga endogena basala nivåer. Därför är transgene modifiering av protein uttryck nivåer och fluorophore taggning av genen av intresse användbara metoder för att studera vägen vid molekylär upplösning. Genetisk manipulation av GCP primära kulturer med liposom-baserade transfection metoder resulterar dock ofta i låg transfection effektivitet, hindrar ytterligare molekylära undersökningar9. Elektroporation ökar effektiviteten men kräver ofta orimliga leverantörsspecifika och celltypsbegränsade elektroporationsreagenser10.
Detta dokument introducerar en högeffektiv och kostnadseffektiv elektroporationsmetod för att manipulera Hh-signalvägskomponenterna i GCP-primärkulturer. Med hjälp av detta modifierade elektroporationsprotokoll levererades ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt Smoothened transgene (pEGFP-Smo) effektivt till GCPs och uppnådde hög cellöverlevnad och transfektion (80-90%). Dessutom, vilket framgår av den immunocytochemical färgning, visade de transfected GCPs hög känslighet för utjämnade agonist-inducerad aktivering av Hh signalvägen genom handel EGFP-Smo till de primära cilierna. Detta protokoll ska vara direkt tillämpligt och fördelaktigt för experiment som inbegriper genetisk modifiering in vitro av celltyper som är svåra att transfektera, såsom primära cellkulturer för människor och gnagare, samt humaninducerade pluripotenta stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transfection av transgenes i primär GCP-kultur genom elektroporationsmetod är vanligtvis associerad med låg cellviabilitet och dålig transfektion effektivitet9,10. Detta dokument introducerar ett kostnadseffektivt och reproducerbart elektroporationsprotokoll som har visat hög effektivitet och livskraft. Dessutom visar vi också en enkel metod för att studera den primära cilium-beroende Hh signalvägen i primära GCP celler.
Andr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av HKBU Seed Fund och Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) till C.H.H. Hor.
Materials
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Biologie du développement. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Biologie du développement. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
