Imagerie tridimensionnelle haute résolution de la vascularisation du repose-pieds dans un modèle murin de gangrène postérieure
Summary
Le présent protocole décrit un modèle unique et cliniquement pertinent de maladie artérielle périphérique qui combine l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase pour induire la gangrène des membres postérieurs chez les souris FVB. La perfusion intracardiaque DiI est ensuite utilisée pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution du système vasculaire du coussinet plantaire.
Abstract
La maladie artérielle périphérique (MAP) est une cause importante de morbidité résultant d’une exposition chronique à des facteurs de risque athérosclérotiques. Les patients souffrant de sa forme la plus grave, l’ischémie chronique menaçant les membres (CLTI), font face à des déficiences substantielles de la vie quotidienne, y compris la douleur chronique, la distance de marche limitée sans douleur et les plaies non cicatrisantes. Des modèles précliniques ont été développés chez divers animaux pour étudier l’AOMI, mais l’ischémie des membres postérieurs de la souris reste la plus largement utilisée. Il peut y avoir une variation significative de la réponse à l’insulte ischémique dans ces modèles en fonction de la souche de souris utilisée et du site, du nombre et des moyens de perturbation artérielle. Ce protocole décrit une méthode unique combinant l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase (NOS) pour induire de manière fiable la gangrène du coussinet plantaire chez les souris du virus ami B (FVB) qui ressemble à la perte tissulaire du CLTI. Alors que les moyens traditionnels d’évaluation de la reperfusion tels que l’imagerie de perfusion Doppler au laser (LDPI) sont toujours recommandés, la perfusion intracardiaque du colorant lipophile 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI) est utilisée pour marquer le système vasculaire. La microscopie confocale à balayage laser à monture entière permet une reconstruction tridimensionnelle (3D) à haute résolution des réseaux vasculaires du coussinet plantaire qui complète les moyens traditionnels d’évaluation de la reperfusion dans les modèles d’ischémie des membres postérieurs.
Introduction
La maladie artérielle périphérique (MAP), caractérisée par une réduction du flux sanguin vers les extrémités en raison de l’athérosclérose, touche 6,5 millions de personnes aux États-Unis et 200 millions de personnes dans le monde1. Les patients atteints d’AOMI présentent une réduction de la fonction et de la qualité de vie des membres, et ceux atteints d’ITLC, la forme la plus grave d’AOMI, courent un risque accru d’amputation et de décès avec un taux de mortalité à 5 ans proche de 50 %2. Dans la pratique clinique, les patients ayant des indices cheville-brachial (ABI) <0,9 sont considérés comme ayant une MAP, et ceux avec ABI <0,4 associés à une douleur au repos ou à une perte de tissu comme ayant CLTI3. Les symptômes varient d’un patient ayant des ABI similaires en fonction de l’activité quotidienne, de la tolérance musculaire à l’ischémie, des variations anatomiques et des différences de développement collatéral4. La gangrène des doigts et des membres est la manifestation la plus grave de toutes les maladies occlusives vasculaires qui entraînent une CLTI. C’est une forme de nécrose sèche qui momifie les tissus mous. En plus de l’AOMI athéroscléreuse, il peut également être observé chez les patients atteints de diabète, de vascularites tels que la maladie de Buerger et le phénomène de Raynaud, ou de calciphylaxie dans le cadre d’une insuffisance rénale terminale5,6.
Plusieurs modèles précliniques ont été développés pour étudier la pathogenèse de l’AOMI/CLTI et tester l’efficacité de traitements potentiels, dont le plus courant reste l’ischémie des membres postérieurs de la souris. L’induction de l’ischémie des membres postérieurs chez la souris est généralement réalisée par l’obstruction du flux sanguin des artères iliaques ou fémorales, soit par ligature de suture, électrocoagulation ou par d’autres moyens de resserrer le vaisseau souhaité7. Ces techniques réduisent considérablement la perfusion au membre postérieur et stimulent la néovascularisation des muscles de la cuisse et du mollet. Cependant, il existe des différences essentielles de sensibilité à l’insulte ischémique en fonction de la souche murine, en partie en raison de différences anatomiques dans la distribution collatérale8,9. Par exemple, les souris C57BL/6 sont relativement résistantes à l’ischémie des membres postérieurs, démontrant une fonction réduite des membres, mais généralement aucune preuve de gangrène dans le coussinet plantaire. D’autre part, les souris BALB / c ont une capacité intrinsèquement faible à récupérer de l’ischémie et développent généralement une auto-amputation du pied ou de la jambe après une ligature de l’artère fémorale seule. Cette réponse sévère à l’ischémie rétrécit la fenêtre thérapeutique et peut empêcher l’évaluation longitudinale de la reperfusion et de la fonction des membres. Fait intéressant, des différences génétiques dans un seul locus de trait quantitatif situé sur le chromosome murin 7 ont été impliquées dans ces susceptibilités différentielles des souris C57BL/6 et BALB/c à la nécrose tissulaire et à la reperfusion des membres10.
Par rapport aux souches C57BL/6 et BALB/c, les souris FVB présentent une réponse intermédiaire mais incohérente à la ligature de l’artère fémorale seule. Certains animaux développent une gangrène de coussinet sous la forme d’ongles ischémiques noirs ou de doigts momifiés, mais d’autres sans aucun signe manifeste d’ischémie11. L’administration concomitante de chlorhydrate d’ester méthylique de Nω-Nitro-L-arginine (L-NAME), un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase (NOS)12, prévient les mécanismes vasodilatateurs compensatoires et augmente encore le stress oxydatif dans les tissus des membres postérieurs. En combinaison avec la ligature ou la coagulation de l’artère fémorale, cette approche produit systématiquement une perte de tissu du coussinet plantaire chez les souris FVB qui ressemble aux changements atrophiques de CLTI mais progresse rarement vers une auto-amputation d’un membre11. Le stress oxydatif est l’une des caractéristiques de l’AOMI/CLTI et se propage par un dysfonctionnement endothélial et une diminution de la biodisponibilité de l’oxyde nitrique (NO)13,14. Le NO est une molécule pluripotente qui exerce habituellement des effets bénéfiques sur le flux sanguin artériel et capillaire, l’adhésion et l’agrégation plaquettaires, ainsi que sur le recrutement et l’activation des leucocytes13. Il a également été démontré que des niveaux réduits de NOS activent l’enzyme de conversion de l’angiotensine, qui induit un stress oxydatif et accélère la progression de l’athérosclérose15.
Une fois qu’un modèle d’ischémie des membres postérieurs est établi, une surveillance de la reperfusion ultérieure des membres et de l’effet thérapeutique de tout traitement potentiel est également nécessaire. Dans le modèle de gangrène murine proposé, le degré de perte tissulaire peut d’abord être quantifié à l’aide du score de Faber pour évaluer l’apparence brute du pied (0: normal, 1-5: perte d’ongles où le score représente le nombre d’ongles affectés, 6-10: atrophie des chiffres où le score représente le nombre de chiffres affectés, 11-12: atrophie partielle et complète du pied, respectivement)9. Les mesures quantitatives de la perfusion des membres postérieurs sont ensuite généralement effectuées à l’aide de LDPI, qui repose sur les interactions Doppler entre la lumière laser et les globules rouges pour indiquer la perfusion au niveau du pixel dans une région d’intérêt (ROI)16. Bien que cette technique soit quantitative, non invasive et idéale pour des mesures répétées, elle ne fournit pas de détails anatomiques granulaires de la vascularisation des membres postérieurs16. D’autres modalités d’imagerie, telles que la micro-tomodensitométrie (micro-CT), l’angiographie par résonance magnétique (ARM) et la microangiographie aux rayons X, s’avèrent soit coûteuses, nécessitant une instrumentation sophistiquée, soit techniquement difficiles16. En 2008, Li et al. ont décrit une technique pour marquer les vaisseaux sanguins dans la rétine avec le colorant lipophile carbocyanine DiI17. DiI incorpore dans les cellules endothéliales et, par diffusion directe, colore les structures de la membrane vasculaire telles que les germes angiogéniques et les processus pseudopodaux17,18. En raison de son administration directe dans les cellules endothéliales et de la nature hautement fluorescente du colorant, cette procédure fournit un marquage intense et durable des vaisseaux sanguins. En 2012, Boden et al. ont adapté la technique de perfusion DiI au modèle d’ischémie des membres postérieurs murins via l’imagerie globale des muscles adducteurs de la cuisse prélevés après la ligature de l’artère fémorale19.
La méthode actuelle fournit un moyen relativement peu coûteux et techniquement réalisable d’évaluer la néovascularisation en réponse à l’ischémie des membres postérieurs et aux thérapies à base de gènes ou de cellules. Dans une autre adaptation, ce protocole décrit l’application de la perfusion DiI pour imager la vascularisation du coussinet plantaire en haute résolution et en 3D dans un modèle murin de gangrène des membres postérieurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que l’ischémie des membres postérieurs de la souris soit le modèle préclinique le plus largement utilisé pour étudier la néovascularisation dans l’AOMI et le CLTI, il existe une variation significative de la gravité et de la récupération de l’ischémie en fonction de la souche de souris spécifique utilisée et du site, du nombre et de la méthode de perturbation artérielle. La combinaison de la ligature de l’artère fémorale et de l’administration IP de L-NAME peut induire de manière fiable l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions à Z-J L et OC V des National Institutes of Health [R01HL149452 et VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Nous remercions également le centre de microscopie et d’imagerie du Miami Project to Cure Paralysis de la faculté de médecine de l’Université de Miami d’avoir fourni un accès à son logiciel d’analyse et de traitement d’images.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system – nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
