Le présent protocole décrit un modèle unique et cliniquement pertinent de maladie artérielle périphérique qui combine l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase pour induire la gangrène des membres postérieurs chez les souris FVB. La perfusion intracardiaque DiI est ensuite utilisée pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution du système vasculaire du coussinet plantaire.
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Article de méthode
Imagerie tridimensionnelle haute résolution de la vascularisation du repose-pieds dans un modèle murin de gangrène postérieure
Dans cet article
Résumé
Résumé
La maladie artérielle périphérique (MAP) est une cause importante de morbidité résultant d’une exposition chronique à des facteurs de risque athérosclérotiques. Les patients souffrant de sa forme la plus grave, l’ischémie chronique menaçant les membres (CLTI), font face à des déficiences substantielles de la vie quotidienne, y compris la douleur chronique, la distance de marche limitée sans douleur et les plaies non cicatrisantes. Des modèles précliniques ont été développés chez divers animaux pour étudier l’AOMI, mais l’ischémie des membres postérieurs de la souris reste la plus largement utilisée. Il peut y avoir une variation significative de la réponse à l’insulte ischémique dans ces modèles en fonction de la souche de souris utilisée et du site, du nombre et des moyens de perturbation artérielle. Ce protocole décrit une méthode unique combinant l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase (NOS) pour induire de manière fiable la gangrène du coussinet plantaire chez les souris du virus ami B (FVB) qui ressemble à la perte tissulaire du CLTI. Alors que les moyens traditionnels d’évaluation de la reperfusion tels que l’imagerie de perfusion Doppler au laser (LDPI) sont toujours recommandés, la perfusion intracardiaque du colorant lipophile 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI) est utilisée pour marquer le système vasculaire. La microscopie confocale à balayage laser à monture entière permet une reconstruction tridimensionnelle (3D) à haute résolution des réseaux vasculaires du coussinet plantaire qui complète les moyens traditionnels d’évaluation de la reperfusion dans les modèles d’ischémie des membres postérieurs.
Introduction
La maladie artérielle périphérique (MAP), caractérisée par une réduction du flux sanguin vers les extrémités en raison de l’athérosclérose, touche 6,5 millions de personnes aux États-Unis et 200 millions de personnes dans le monde1. Les patients atteints d’AOMI présentent une réduction de la fonction et de la qualité de vie des membres, et ceux atteints d’ITLC, la forme la plus grave d’AOMI, courent un risque accru d’amputation et de décès avec un taux de mortalité à 5 ans proche de 50 %2. Dans la pratique clinique, les patients ayant des indices cheville-brachial (ABI) <0,9 sont considérés comme ayant une MAP, et ceux a....
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux décrites dans le protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Miami (IACUC). Des souris FVB, mâles et femelles, âgées de 8 à 12 semaines, ont été utilisées pour l’étude.
1. Préparation de la solution L-NAME
- Dans des conditions stériles dans une hotte à écoulement laminaire, préparer une solution mère L-NAME en dissolvant 1 g de poudre L-NAME (voir tableau des matériaux) avec 20 mL d’eau stérile pour obtenir une solution de 50 mg/mL. Conserver la solution mère dans des aliquotes de 300 à 500....
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Résultats
Ce protocole détaille un moyen fiable d’induire une ischémie et une perte de tissu dans le coussinet plantaire murin en utilisant une combinaison de coagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration de L-NAME, un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase, chez les souris FVB sensibles. La figure 1 détaille l’anatomie du système vasculaire des membres postérieurs murins et indique les sites de l’artère fémorale et de la coagulation veineuse (X jaune), juste proximaux à l’artè.......
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Discussion
Bien que l’ischémie des membres postérieurs de la souris soit le modèle préclinique le plus largement utilisé pour étudier la néovascularisation dans l’AOMI et le CLTI, il existe une variation significative de la gravité et de la récupération de l’ischémie en fonction de la souche de souris spécifique utilisée et du site, du nombre et de la méthode de perturbation artérielle. La combinaison de la ligature de l’artère fémorale et de l’administration IP de L-NAME peut induire de manière fiable la gangrène des membres posté.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions à Z-J L et OC V des National Institutes of Health [R01HL149452 et VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Nous remercions également le centre de microscopie et d’imagerie du Miami Project to Cure Paralysis de la faculté de médecine de l’Université de Miami d’avoir fourni un accès à son logiciel d’analyse et de traitement d’images.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pinces à reliure (petites) | Magasin | ||
| Buprénorphine (à libération prolongée) | |||
| Aiguille papillon (25 G avec Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Microscope confocal à balayage laser | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-perchlorate de tétraméthylindocarbocyanine) | Invitrogen | D282 | |
| Dispositif d’électrocautérisation | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Éthanol (100 %) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) logiciel | NIH | Version d’occasion 2.1.0. Téléchargement gratuit, sans licence. | |
| Coussinets de biopsie en mousse | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formol (tamponné neutre, 10 %) | VWR | 89370-094 | |
| Souris FVB | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Version d’occasion 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Kétamine | |||
| L-NAME (chlorhydrate d’ester méthylique N&omega ;-Nitro-L-arginine) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Imageur de perfusion laser Doppler | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Logiciel moorLDI V5 d’occasion. |
| Lames de microscope (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Aiguilles (27 G) | BD | 305109 | |
| Écouvillon à la povidone iodée (10 %) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Instruments chirurgicaux | Roboz Surgical | Des pinces fines, un tourne-aiguille, des ciseaux à ressort et un hémostat sont recommandés. | |
| Suture (5-0 résorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Seringues (10 mL) | BD | 305482 | |
| Robinets d’arrêt à trois voies | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Plugin d’analyse vasculaire Téléchargement | gratuit, sans licence requise. Voir la référence : Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
Références
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of ....
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Réimpressions et autorisations
