Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse für die Erstliniendiagnose der primären ziliären Dyskinesie
Summary
Die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse ist ein relativ einfach durchzuführendes, schnelles, kostengünstiges und in erfahrenen Händen ein äußerst zuverlässiges Werkzeug für die Erstliniendiagnostik der primären ziliären Dyskinesie, das in jedem an der Diagnostik und Behandlung schwerer Lungenerkrankungen beteiligten Zentrum zur Verfügung stehen sollte.
Abstract
Die primäre ziliäre Dyskinesie (PKD) ist eine angeborene Erkrankung, die überwiegend autosomal-rezessiv vererbt wird. Die Störung verursacht eine Störung der Bewegung von Zilien, was zu einer schweren Beeinträchtigung der mukoziliären Clearance (MCC) führt. Wenn der Zustand nicht diagnostiziert oder zu spät diagnostiziert wird, führt er zur Entwicklung von Bronchiektasen und schweren Schäden an der Lunge im späteren Leben. Die meisten Methoden zur Diagnose von PCD sind zeitaufwendig und erfordern umfangreiche wirtschaftliche Ressourcen, um sie zu etablieren. Die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie-Analyse (HSVMA) ist das einzige diagnostische Werkzeug zur Visualisierung und Analyse lebender Atemwegszellen mit schlagenden Zilien in vitro. Es ist schnell, kostengünstig und in erfahrenen Händen als Diagnosewerkzeug für PKD sehr zuverlässig. Darüber hinaus sind klassische diagnostische Maßnahmen wie die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) für einige Mutationen nicht anwendbar, da morphologische Veränderungen fehlen.
Diese Arbeit beschreibt den Prozess der Sammlung von Atemwegsepithelzellen, die weitere Vorbereitung der Probe und den Prozess von HSVMA. Wir beschreiben auch, wie gebürstete Zellen erfolgreich unversehrt und geschlagen gehalten werden können, indem sie in einem Nährmedium zur Lagerung und zum Transport zum Untersuchungsort aufbewahrt werden, wenn eine Klinik nicht über die Ausrüstung zur Durchführung von HSVMA verfügt. Gezeigt werden auch Videos mit pathologischen Schlagmustern von Patienten mit einer Mutation im Dynein-Arm-Schwerketten-11-Gen (DNAH11), die nicht mit TEM diagnostiziert werden können; das Ergebnis eines nicht schlüssigen HSVMA aufgrund einer Infektion der oberen Atemwege sowie eines erfolglosen Bürstens mit Überlagerung von roten Blutkörperchen. Mit diesem Artikel möchten wir jede Einheit, die sich mit Pneumologiepatienten und seltenen Lungenerkrankungen befasst, ermutigen, HSVMA als Teil ihrer täglichen Routinediagnostik für PCD durchzuführen oder die Proben an ein Zentrum zu senden, das auf die Durchführung von HSVMA spezialisiert ist.
Introduction
Die primäre ziliäre Dyskinesie (PCD) ist eine seltene, erbliche genetische Störung, die Störungen in der Bewegung der schlagenden Zilien verursacht. Wenn es nicht diagnostiziert wird, führt es zu schweren Lungenschäden im späteren Leben aufgrund einer schweren Beeinträchtigung der MCC. In der Vergangenheit wurde seine Prävalenz auf den Bereich von 1:4.000 bis 50.000 geschätzt. Aufgrund der sich ständig verbessernden Diagnostik und eines wachsenden Bewusstseins für die Erkrankung deuten Aktualisierungen der Prävalenz der PCD darauf hin, dass sie viel häufiger auftreten könnte und wahrscheinlich im Bereich von 1:4.000 bis 20.000 statt 1,2 liegen könnte. Patienten mit PCD werden jedoch immer noch unterdiagnostiziert oder zu spät diagnostiziert 1,3. Daher sollten Säuglinge mit entweder angeborenem Situs inversus und / oder Heterotaxie oder perinataler Rhinorrhoe, neonataler Atemnot, einer blockierten Nase und Fütterungsschwierigkeiten verdächtig für PCD sein. Im späteren Leben sind chronische Otitis, wiederkehrende Lungenentzündung, Rhinosinusitis und ein chronischer, typischer nasser Husten aufgrund einer gestörten MCC die charakteristischen Symptome der PCD, die in Kombination mit Bronchiektasen und eingeschränkter Lungenfunktion bis ins Erwachsenenalter andauern2.
Patienten mit Verdacht auf PCD können mit verschiedenen diagnostischen Instrumenten diagnostiziert werden. TEM galt in der Vergangenheit als Goldstandard für die Erstliniendiagnostik. Bis zu 30% der PCD-Fälle zeigen jedoch keine abnormale Ultrastruktur 1,3,4,5,6, was einen anderen diagnostischen Ansatz erfordert. Daher empfehlen eine wachsende Zahl von Zentren und die Richtlinien der European Respiratory Society (ERS) eine Kombination von nasales Stickstoffmonoxid (nNO) und HSVMA als Erstliniendiagnostik 1,7,9,10. HSVMA und nNO sind auch die kostengünstigsten Optionen zur Identifizierung eines Patienten mit PCD11. Aber auch wenn Gentests in die Diagnostik einbezogen wurden, muss bedacht werden, dass es derzeit keinen eigenständigen Test oder eine Kombination von Tests gibt, die eine PCD mit 100%iger Sicherheitausschließen können 8,9,10.
Von den verfügbaren diagnostischen Optionen ist HSVMA der einzige Test, der sich auf lebende, mit Zilien beschichtete Atemzellen konzentriert und das Ziliarschlagmuster (CBP) und die Ziliarschlagfrequenz (CBF) bewertet. Im Gegensatz zu TEM sind die Ergebnisse von HSVMA schnell verfügbar, in der Regel am Tag der Prüfung, während die Ergebnisse von TEM Monate nach der Entnahme der Probe eintreffen können. HSVMA kann für alle Altersgruppen angewendet werden, während nNO ein hohes Maß an Compliance verlangt; Versuche, es unter dem Alter von 5 Jahren zu verwenden, sind in der Regel erfolglos10. In erfahrenen Händen hat HSVMA eine ausgezeichnete Sensitivität und Spezifität, um PCD bei 100% bzw. 96% bzw.12% zu diagnostizieren.
Dieses Papier beschreibt das Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Durchführung von HSVMA, einschließlich der Ernte von mit Zilien überzogenen Atemwegszellen aus dem unteren Nasenrechen, der Konservierung von geernteten Zellen in einem zellnährenden Medium für den Transport zum Untersuchungsort und dem Prozess der mikroskopischen Videoanalyse zur Bestimmung von CBF und CBP. Zusätzlich werden einige Videoclips von Patienten gezeigt, in denen normale CBPs und CBFs mit abnormaler Zilienfunktion verglichen werden (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 und Video 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird der diagnostische Prozess für PCD mittels HSVMA im Lichte der Erstliniendiagnostik beschrieben und diskutiert. Obwohl HSVMA relativ einfach zu etablieren, kostengünstig11 und eine zuverlässige Methode in erfahrenen Händen12 ist, ist es keine diagnostische Maßnahme ohne Fallstricke. Abnorme CBF und CBP können auf eine Sekundärinfektion zurückzuführen sein, die zu einer Entzündung des broncho-respiratorischen Epithels15 führt, und …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Besonderen Dank gilt der Kinderkrankenschwester Frau Johanna Juvankoski für ihre hervorragende Hilfe bei den Bürsten. Einen besonderen Dank gilt auch Professor Heymut Omran (Universitätsklinikum Münster, UKM) für die Erlaubnis, die schematische Abbildung der normalen Ziliarbewegung von ihrer Website aus verwenden zu dürfen. Abschließend möchten wir Herrn Alan Brown BA (Hons), PGCE, für das Korrekturlesen des Manuskripts danken.
Materials
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
References
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
