Analisi video al microscopio ad alta velocità per la diagnosi di prima linea della discinesia ciliare primaria
Summary
L’analisi videomicroscopica ad alta velocità è uno strumento relativamente facile da eseguire, veloce, economico e, in mani esperte, uno strumento considerevolmente affidabile per la diagnostica di prima linea della discinesia ciliare primaria, che dovrebbe essere disponibile in ogni centro coinvolto nella diagnostica e nel trattamento di gravi malattie polmonari.
Abstract
La discinesia ciliare primaria (PCD) è una malattia congenita prevalentemente ereditata in un tratto autosomico recessivo. Il disturbo provoca disturbi nel movimento delle ciglia, portando a una grave compromissione della clearance mucociliare (MCC). Se non diagnosticata o diagnosticata troppo tardi, la condizione porta allo sviluppo di bronchiectasie e gravi danni ai polmoni in età avanzata. La maggior parte dei metodi per diagnosticare la PCD richiedono molto tempo e richiedono ampie risorse economiche per stabilirli. L’analisi videomicroscopica ad alta velocità (HSVMA) è l’unico strumento diagnostico per visualizzare e analizzare le cellule respiratorie viventi con ciglia battenti in vitro. È veloce, economico e, in mani esperte, molto affidabile come strumento diagnostico per PCD. Inoltre, le misure diagnostiche classiche come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) non sono applicabili per alcune mutazioni in quanto i cambiamenti morfologici sono assenti.
Questo documento descrive il processo di raccolta delle cellule epiteliali respiratorie, l’ulteriore preparazione del campione e il processo di HSVMA. Descriviamo anche come le cellule spazzolate possono essere mantenute con successo illese e picchiate tenendole in un mezzo nutriente per lo stoccaggio e il trasporto al sito di indagine nei casi in cui una clinica non possiede l’attrezzatura per eseguire HSVMA. Vengono mostrati anche video con modelli di battito patologico di pazienti con una mutazione nel gene della catena pesante del braccio di dineina 11 (DNAH11), che non può essere diagnosticato con TEM; il risultato di un HSVMA inconcludente a causa dell’infezione delle vie aeree superiori, nonché di una spazzolatura infruttuosa con sovrapposizione di globuli rossi. Con questo articolo, vorremmo incoraggiare ogni unità che si occupa di pazienti pneumologici e malattie polmonari rare a eseguire HSVMA come parte della loro diagnostica di routine quotidiana per PCD o inviare i campioni a un centro specializzato nell’esecuzione di HSVMA.
Introduction
La discinesia ciliare primaria (PCD) è una rara malattia genetica ereditaria, che causa disturbi nel movimento delle ciglia che battono. Se non diagnosticato, porta a gravi danni polmonari in età avanzata a causa di una grave compromissione del MCC. In passato, la sua prevalenza è stata stimata nell’intervallo da 1:4.000 a 50.000. A causa del costante miglioramento della diagnostica e di una crescente consapevolezza della condizione, gli aggiornamenti sulla prevalenza della PCD suggeriscono che potrebbe essere molto più comune e probabilmente nell’intervallo da 1: 4.000 a 20.000 invecedi 1,2. Tuttavia, i pazienti con PCD sono ancora sottodiagnosticati o diagnosticati troppo tardi 1,3. Pertanto, i neonati con situs inversus congenito e/o eterotassia o rinorrea perinatale, distress respiratorio neonatale, naso chiuso e difficoltà di alimentazione dovrebbero essere sospetti per la PCD. In età avanzata, otite cronica, polmonite ricorrente, rinosinusite e una tosse umida cronica e tipica a causa di MCC compromesso sono i sintomi caratteristici della PCD, che in combinazione con bronchiectasie e compromissione della funzione polmonare, continuano nell’età adulta2.
I pazienti sospettati di avere PCD possono essere diagnosticati utilizzando diversi strumenti diagnostici. TEM è stato considerato il gold standard per la diagnostica di prima linea in passato. Tuttavia, fino al 30% dei casi di PCD non mostra un’ultrastruttura anormale 1,3,4,5,6, richiedendo un approccio diagnostico diverso. Pertanto, un numero crescente di centri e le linee guida della European Respiratory Society (ERS) suggeriscono una combinazione di ossido nitrico nasale (nNO) e HSVMA come diagnostica di prima linea 1,7,9,10. HSVMA e nNO sono anche le opzioni più convenienti nell’identificazione di un paziente con PCD11. Tuttavia, anche se i test genetici fossero inclusi nella diagnostica, si deve tenere presente che attualmente non esiste un test autonomo o una combinazione di test che possa escludere la PCD con certezza al 100% 8,9,10.
Tra le opzioni diagnostiche disponibili, HSVMA è l’unico test che si concentra sulle cellule respiratorie viventi rivestite di ciglia e valuta il modello di battito ciliare (CBP) e la frequenza del battito ciliare (CBF). A differenza di TEM, i risultati di HSVMA sono disponibili rapidamente, di solito il giorno del test, mentre i risultati di TEM potrebbero arrivare mesi dopo che il campione è stato prelevato. HSVMA può essere applicato a tutte le fasce d’età, mentre nNO richiede un alto grado di conformità; i tentativi di usarlo sotto i 5 anni di solito non hanno successo10. In mani esperte, HSVMA ha un’eccellente sensibilità e specificità per diagnosticare la PCD al 100% e al 96%, rispettivamente12.
Questo documento descrive la procedura passo-passo per eseguire HSVMA, compresa la raccolta di cellule respiratorie rivestite di ciglia dal turbinato inferiore del naso, la conservazione delle cellule raccolte in un mezzo nutritivo cellulare per il trasporto al sito di indagine e il processo di analisi video microscopica per determinare CBF e CBP. Inoltre, vengono mostrati alcuni video clip dei pazienti, confrontando CBP e CFF normali con funzione ciglia anormale (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 e Video 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, il processo diagnostico per PCD utilizzando HSVMA è descritto e discusso alla luce della diagnostica di prima linea. Nonostante sia relativamente facile da stabilire, conveniente11 e un metodo affidabile in maniesperte 12, HSVMA non è una misura diagnostica senza insidie. CBF e CBP anormali possono essere dovuti a infezioni secondarie, che portano all’infiammazione dell’epitelio bronco-respiratorio15 e, per lo stesso motivo, gli individui che …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desideriamo esprimere un ringraziamento speciale all’infermiera pediatrica Johanna Juvankoski per il suo eccellente aiuto con le spazzolature. Vorremmo anche esprimere una speciale gratitudine al professor Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) per aver concesso il permesso di utilizzare la figura schematica del normale movimento ciliare dal loro sito web. Infine, vorremmo ringraziare il signor Alan Brown BA (Hons), PGCE, per la correzione di bozze del manoscritto.
Materials
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
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