Análise de microscopia de vídeo de alta velocidade para diagnóstico de primeira linha da dyskinesia ciliar primária
Summary
A análise de microscopia de vídeo de alta velocidade é uma análise relativamente fácil de executar, rápida, econômica e, em mãos experientes, uma ferramenta consideravelmente confiável para diagnósticos de primeira linha de dyskinesia ciliar primária, que deve estar disponível em todos os centros envolvidos em diagnósticos e no tratamento de doenças pulmonares graves.
Abstract
A discnesia ciliar primária (PCD) é uma doença congênita predominantemente herdada em um traço recessivo autossômico. O transtorno causa perturbação no movimento do cílio, levando a grave comprometimento do desmatamento mucociliar (CCM). Se não diagnosticada ou diagnosticada tarde demais, a condição leva ao desenvolvimento de bronquiectase e danos graves aos pulmões na vida posterior. A maioria dos métodos de diagnóstico de PCD são demorados e exigem amplos recursos econômicos para estabelecê-los. A análise de microscopia de vídeo de alta velocidade (HSVMA) é a única ferramenta de diagnóstico para visualizar e analisar células respiratórias vivas com cílios in vitro. É rápido, econômico e, em mãos experientes, muito confiável como ferramenta de diagnóstico para PCD. Além disso, medidas diagnósticas clássicas como a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) não são aplicáveis para algumas mutações, pois as alterações morfológicas estão ausentes.
Este artigo descreve o processo de coleta de células epiteliais respiratórias, a preparação posterior da amostra e o processo de HSVMA. Também descrevemos como as células escovadas podem ser mantidas ilesas e batendo, mantendo-as em um meio nutritivo para armazenamento e transporte para o local de investigação nos casos em que uma clínica não possui o equipamento para realizar o HSVMA. Também são mostrados vídeos com padrões patológicos de espancamento de pacientes com uma mutação no braço dynein cadeia pesada 11 gene (DNAH11), que não pode ser diagnosticado com TEM; o resultado de um HSVMA inconclusivo devido à infecção das vias aéreas superiores, bem como uma escovação mal sucedida com superposição de glóbulos vermelhos. Com este artigo, gostaríamos de incentivar todas as unidades que lidam com pacientes de pneumologia e doenças pulmonares raras a realizar o HSVMA como parte de seus diagnósticos diários de rotina para PCD ou enviar os espécimes para um centro especializado na realização do HSVMA.
Introduction
A discnesia ciliar primária (PCD) é uma doença genética rara e hereditária, que causa distúrbios no movimento de bater cílios. Se não diagnosticado, leva a danos pulmonares graves na vida posterior devido ao grave comprometimento do CCM. No passado, sua prevalência foi estimada na faixa de 1:4.000 a 50.000. Devido à melhoria constante dos diagnósticos e à crescente conscientização sobre a condição, atualizações sobre a prevalência de PCD sugerem que pode ser muito mais comum e provavelmente na faixa de 1:4.000 a 20.000 em vezde 1,2. No entanto, os pacientes com PCD ainda são subdiagnosticados ou diagnosticados tarde demais 1,3. Portanto, bebês com situs inversus congênito e/ou heterotaxia ou rinorreia perinatal, problemas respiratórios neonatais, nariz entupido e dificuldades de alimentação devem ser suspeitos para PCD. Na vida posterior, otite crônica, pneumonia recorrente, rinosinusite e uma tosse úmida crônica e típica devido ao MCC prejudicado são os sintomas marcantes do PCD, que em combinação com bronquiectase e função pulmonar prejudicada, continuam até a idade adulta2.
Pacientes com suspeita de PCD podem ser diagnosticados usando diferentes ferramentas de diagnóstico. O TEM foi considerado o padrão-ouro para diagnósticos de primeira linha no passado. No entanto, até 30% dos casos de PCD não apresentam ultraestrutura anormal 1,3,4,5,6, exigindo uma abordagem diagnóstica diferente. Portanto, um número crescente de centros e as diretrizes da Sociedade Respiratória Europeia (ERS) sugerem uma combinação de óxido nítrico nasal (nNO) e HSVMA como diagnósticos de primeira linha 1,7,9,10. HSVMA e nNO também são as opções mais econômicas na identificação de um paciente com PCD11. No entanto, mesmo que os testes genéticos tenham sido incluídos nos diagnósticos, deve-se ter em mente que atualmente não há nenhum teste autônomo ou combinação de testes que possam excluir pcd com 100% de certeza 8,9,10.
Das opções de diagnóstico disponíveis, o HSVMA é o único teste que se concentra em células respiratórias vivas, revestidas de cílios e avalia o padrão de batida ciliar (CBP) e a frequência de batida ciliar (CBF). Em contraste com o TEM, os resultados do HSVMA estão disponíveis rapidamente, geralmente no dia do teste, enquanto os resultados do TEM podem chegar meses após a coleta da amostra. O HSVMA pode ser aplicado para todas as faixas etárias, enquanto o NNO exige um alto grau de conformidade; tentativas de usá-lo com menos de 5 anos geralmente são mal sucedidas10. Em mãos experientes, o HSVMA tem excelente sensibilidade e especificidade para diagnosticar PCD em 100% e 96%, respectivamente12.
Este artigo descreve o procedimento passo-a-passo para a realização do HSVMA, incluindo a colheita de células respiratórias revestidas de cílios a partir do turbinado inferior do nariz, a preservação de células colhidas em um meio nutritivo celular para transporte para o local de investigação, e o processo de análise de vídeo microscópico para determinar CBF e CBP. Além disso, alguns videoclipes de pacientes são mostrados, comparando CBPs normais e CBFs com função cília anormal (Vídeo 3, Vídeo 4, Vídeo 5, Vídeo 6, Vídeo 7 e Vídeo 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, o processo de diagnóstico para PCD usando HSVMA é descrito e discutido à luz dos diagnósticos de primeira linha. Apesar de ser relativamente fácil de estabelecer,11 econômico e um método confiável em mãos experientes12, o HSVMA não é uma medida de diagnóstico sem armadilhas. A CBF e o CBP anormal podem ser devido a infecções secundárias, levando à inflamação da epithelia bronco-respiratória15, e pelo mesmo motivo, os indivíd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos expressar agradecimentos especiais à enfermeira pediátrica Sra. Johanna Juvankoski por sua excelente ajuda com as escovas. Gostaríamos também de expressar uma gratidão especial ao professor Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) por conceder permissão para usar a figura esquemática do movimento ciliar normal de seu site. Finalmente, gostaríamos de agradecer ao Sr. Alan Brown BA (Hons), PGCE, pela revisão do manuscrito.
Materials
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
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