Análisis de microscopía de video de alta velocidad para el diagnóstico de primera línea de discinesia ciliar primaria
Summary
El análisis de microscopía de video de alta velocidad es una herramienta relativamente fácil de realizar, rápida, rentable y, en manos experimentadas, una herramienta considerablemente confiable para el diagnóstico de primera línea de la discinesia ciliar primaria, que debe estar disponible en todos los centros involucrados en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades pulmonares graves.
Abstract
La discinesia ciliar primaria (PCD) es un trastorno congénito predominantemente hereditario en un rasgo autosómico recesivo. El trastorno causa alteración en el movimiento de los cilios, lo que lleva a un deterioro grave del aclaramiento mucociliar (CCM). Si no se diagnostica o se diagnostica demasiado tarde, la afección conduce al desarrollo de bronquiectasias y daños graves a los pulmones en la vida posterior. La mayoría de los métodos para diagnosticar la PCD consumen mucho tiempo y exigen amplios recursos económicos para establecerlos. El análisis de videomicscopía de alta velocidad (HSVMA) es la única herramienta de diagnóstico para visualizar y analizar células respiratorias vivas con cilios golpeadores in vitro. Es rápido, rentable y, en manos experimentadas, muy confiable como herramienta de diagnóstico para PCD. Además, las medidas diagnósticas clásicas, como la microscopía electrónica de transmisión (TEM), no son aplicables a algunas mutaciones, ya que los cambios morfológicos están ausentes.
Este artículo describe el proceso de recolección de células epiteliales respiratorias, la preparación posterior de la muestra y el proceso de HSVMA. También describimos cómo las células cepilladas pueden mantenerse con éxito ilesas y latiendo manteniéndolas en un medio nutritivo para su almacenamiento y transporte al sitio de investigación en los casos en que una clínica no posee el equipo para realizar HSVMA. También se muestran videos con patrones de latidos patológicos de pacientes con una mutación en el gen de cadena pesada 11 del brazo de dineína (DNAH11), que no puede ser diagnosticado con TEM; el resultado de una HSVMA no concluyente debido a una infección de las vías respiratorias superiores, así como un cepillado fallido con superposición de glóbulos rojos. Con este artículo, nos gustaría alentar a cada unidad que se ocupa de pacientes de neumología y enfermedades pulmonares raras a realizar HSVMA como parte de sus diagnósticos de rutina diaria para PCD o enviar las muestras a un centro especializado en la realización de HSVMA.
Introduction
La discinesia ciliar primaria (PCD) es un trastorno genético hereditario poco frecuente, que causa alteraciones en el movimiento de los cilios golpeados. Si no se diagnostica, conduce a un daño pulmonar grave en la vida posterior debido a un deterioro grave del CCM. En el pasado, su prevalencia se ha estimado en el rango de 1:4.000 a 50.000. Debido a la mejora constante de los diagnósticos y una creciente conciencia de la afección, las actualizaciones sobre la prevalencia de pcD sugieren que podría ser mucho más común y probablemente en el rango de 1: 4,000 a 20,000 en lugarde 1,2. Sin embargo, los pacientes con PCD todavía están infradiagnosticados o diagnosticados demasiado tarde 1,3. Por lo tanto, los lactantes con situs inversus congénito y/o heterotaxia o rinorrea perinatal, dificultad respiratoria neonatal, nariz tapada y dificultades de alimentación deben ser sospechosos de PCD. En la vida posterior, la otitis crónica, la neumonía recurrente, la rinosinusitis y una tos húmeda crónica y típica debido a un CCM deteriorado son los síntomas distintivos de la PCD, que en combinación con la bronquiectasia y la función pulmonar deteriorada, continúan en la edad adulta2.
Los pacientes sospechosos de tener PCD pueden ser diagnosticados mediante el uso de diferentes herramientas de diagnóstico. TEM ha sido considerado el estándar de oro para el diagnóstico de primera línea en el pasado. Sin embargo, hasta el 30% de los casos de PCD no muestran una ultraestructura anormal 1,3,4,5,6, lo que exige un enfoque diagnóstico diferente. Por lo tanto, un número creciente de centros y las directrices de la Sociedad Respiratoria Europea (ERS) sugieren una combinación de óxido nítrico nasal (nNO) y HSVMA como diagnósticos de primera línea 1,7,9,10. HSVMA y nNO también son las opciones más rentables para identificar a un paciente con PCD11. Sin embargo, incluso si las pruebas genéticas se incluyeran en los diagnósticos, debe tenerse en cuenta que actualmente no existe una prueba independiente o una combinación de pruebas que pueda excluir la PCD con una certeza del 100% 8,9,10.
De las opciones de diagnóstico disponibles, HSVMA es la única prueba que se centra en las células respiratorias vivas recubiertas de cilios y evalúa el patrón de latido ciliar (CBP) y la frecuencia de latido ciliar (CBF). A diferencia de TEM, los resultados de HSVMA están disponibles rápidamente, generalmente el día de la prueba, mientras que los resultados de TEM pueden llegar meses después de que se haya tomado la muestra. HSVMA se puede aplicar a todos los grupos de edad, mientras que nNO exige un alto grado de cumplimiento; los intentos de usarlo menores de 5 años suelen ser infructuosos10. En manos experimentadas, HSVMA tiene una excelente sensibilidad y especificidad para diagnosticar PCD al 100% y 96%, respectivamente12.
Este documento describe el procedimiento paso a paso para realizar HSVMA, incluida la recolección de células respiratorias recubiertas de cilios del cornete inferior de la nariz, la preservación de las células cosechadas en un medio que nutre las células para su transporte al sitio de investigación y el proceso de análisis de video microscópico para determinar CBF y CBP. Además, se muestran algunos videoclips de pacientes, comparando CBP y CPF normales con la función anormal de los cilios (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 y Video 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, el proceso de diagnóstico para PCD utilizando HSVMA se describe y discute a la luz de los diagnósticos de primera línea. A pesar de ser relativamente fácil de establecer, rentable11 y un método confiable en manos experimentadas12, HSVMA no es una medida diagnóstica sin trampas. La CBF y la CBP anormales pueden deberse a una infección secundaria, lo que lleva a la inflamación de los epitelios bronco-respiratorios15, y por la misma razó…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deseamos expresar un agradecimiento especial a la enfermera pediátrica Sra. Johanna Juvankoski por su excelente ayuda con los cepillados. También nos gustaría expresar un agradecimiento especial al profesor Heymut Omran (University Clinic Münster, UKM) por otorgar permiso para usar la figura esquemática del movimiento ciliar normal de su sitio web. Por último, quisiéramos dar las gracias al Sr. Alan Brown BA (Hons), PGCE, por la revisión del manuscrito.
Materials
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
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