En este protocolo, se describe un modelo de colitis por transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno de la microbiota intestinal. Las células T CD4+ se aíslan de ratones transgénicos CBir1 TCR. Estos son específicos para un antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal CBir1 flagelina, que se transfiere a los ratones Rag1-/- receptores, lo que lleva a la inflamación intestinal.
Con el aumento de la incidencia, las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que son enfermedades crónicas que afectan el tracto gastrointestinal, imponen una carga financiera y de salud considerable a los individuos y la sociedad. Por lo tanto, es fundamental investigar los mecanismos subyacentes a la patogénesis y el desarrollo de la EII. Aquí, se describe un modelo de colitis por transferencia de células T específica del antígeno de la microbiota intestinal. La flagelina CBir1 ha sido reconocida como el antígeno bacteriano intestinal inmunodominante en la colitis experimental y en pacientes con enfermedad de Crohn. Las células T CD4+ transgénicas CBir1 TCRA T, específicas de la flagelina CBir1, pueden inducir colitis crónica después de la transferencia adoptiva a ratones Rag1-/- inmunodeficientes. La gravedad de la enfermedad se evalúa mediante histopatología. También se determinan los fenotipos de linfocitos T CD4+ en la lámina propia colónica. Este modelo se asemeja mucho al desarrollo de la EII, que proporciona un modelo murino ideal para investigar los mecanismos que impulsan la patogénesis de la EII y probar los medicamentos potenciales para tratar la EII.
Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que incluyen principalmente la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), se caracterizan por una inflamación crónica del tracto gastrointestinal recurrente-remitente, que afecta a millones de personas en todo el mundo1. Varios factores se han implicado en el desarrollo y la patogénesis de la EII, incluyendo la susceptibilidad genética, la microbiota intestinal, las respuestas inmunes, la dieta y el estilo de vida2. Sin embargo, el mecanismo exacto de la EII aún no se entiende completamente.
Uno de los intereses particulares es la interacción entre la microbiota intestinal y las respuestas inmunes del huésped en la regulación de la inflamación intestinal3. La microbiota intestinal proporciona una serie de moléculas y antígenos inmunoestimulantes, que pueden activar las respuestas inmunitarias4. Si bien el equilibrio entre las células T efectoras y las células T reguladoras (Tregs) es fundamental para mantener la homeostasis intestinal, la respuesta excesiva de las células T CD4+ de la mucosa intestinal a los antígenos de la microbiota intestinal contribuye a la inflamación intestinal5,6,7. Como antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal, la flagelina CBir1 se ha relacionado con la patogénesis del CD8 humano,9. Además, la transferencia de células T transgénicas (Tg) CBir1 TCR induce inflamación intestinal en ratones inmunodeficientes6, muy parecida a la EII humana, lo que indica que este modelo de transferencia de células T ayuda a investigar los mecanismos de la EII humana.
Este trabajo describe el protocolo detallado de inducción de colitis en ratones Rag1-/- mediante transferencia adoptiva de células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ y la evaluación de la gravedad de la enfermedad. Además, se muestran los resultados anticipados y se discuten los pasos críticos del procedimiento y la solución de problemas, lo que ayudará a los investigadores a investigar los mecanismos de patogénesis de la inflamación intestinal y probar los posibles medicamentos para tratar la EII.
Aunque cada paso es esencial para la reproducibilidad de este modelo de colitis, hay varios pasos críticos. Los ratones Rag-/- receptores deben recibir células T CD4+ naϊve viables adecuadas para inducir la inflamación intestinal. Utilizamos bazos para el aislamiento de células T CD4+ ingenuas en lugar de MLNs. Porque el rendimiento de las células T CD4+ ingenuas en las MLN es mucho menor que en los bazos. CD62L está altamente expresado en linfocitos T naïve, y…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones DK125011, AI150210 y DK124132 de los Institutos Nacionales de Salud, el premio STARs del Sistema de la Universidad de Texas (Y.C.) y el Fondo de Becas James W. McLaughlin de la Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston (W.Y.). La Figura 1 se creó con BioRender.com.
0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | ||
EDTA | Corning | 46-034-CI | |
EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
FBS | R&D Systems | S11550 | |
Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |