Induction de l’inflammation intestinale par transfert adoptif de lymphocytes T CD4+ transgéniques CBir1 TCR à des souris immunodéficientes
Summary
Dans ce protocole, un modèle de colite adoptive de transfert de lymphocytes T spécifiques à l’antigène du microbiote intestinal est décrit. Les lymphocytes T CD4+ sont isolés à partir de souris transgéniques TCR CBir1. Ceux-ci sont spécifiques pour un antigène immunodominant du microbiote intestinal CBir1 flagellin, qui est transféré dans les souris Rag1-/- receveuses, entraînant une inflammation intestinale.
Abstract
Avec l’augmentation de l’incidence, les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), qui sont des maladies chroniques affectant le tractus gastro-intestinal, imposent un fardeau sanitaire et financier considérable aux individus et à la société. Par conséquent, il est essentiel d’étudier les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse et au développement des MII. Ici, un modèle de colite de transfert de lymphocytes T spécifiques à l’antigène du microbiote intestinal est décrit. La flagelline CBir1 a été reconnue comme l’antigène bactérien intestinal immunodominant dans la colite expérimentale et les patients atteints de la maladie de Crohn. Les lymphocytes T CD4+ transgéniques CBir1 TCR, spécifiques à la flagelline CBir1, peuvent induire une colite chronique après transfert adoptif chez des souris Rag1-/- immunodéficientes . La gravité de la maladie est évaluée par histopathologie. Les phénotypes des lymphocytes T CD4+ dans la lamina propria du côlon sont également déterminés. Ce modèle ressemble beaucoup au développement de la MII, qui fournit un modèle murin idéal pour étudier les mécanismes à l’origine de la pathogenèse des MII et tester les médicaments potentiels pour traiter les MII.
Introduction
Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), y compris principalement la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU), sont caractérisées par une inflammation chronique récurrente-rémittente du tractus gastro-intestinal, qui touche des millions de personnes dans le monde1. Plusieurs facteurs ont été impliqués dans le développement et la pathogenèse des MII, notamment la susceptibilité génétique, le microbiote intestinal, les réponses immunitaires, l’alimentation et le mode de vie2. Cependant, le mécanisme exact de la MII n’est pas encore complètement compris.
L’un des intérêts particuliers est l’interaction entre le microbiote intestinal et les réponses immunitaires de l’hôte dans la régulation de l’inflammation intestinale3. Le microbiote intestinal fournit une série de molécules immunostimulantes et d’antigènes, qui peuvent activer les réponses immunitaires4. Alors que l’équilibre entre les lymphocytes T effecteurs et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) est essentiel au maintien de l’homéostasie intestinale, la réponse excessive des lymphocytes T CD4+ de la muqueuse intestinale aux antigènes du microbiote intestinal contribue à l’inflammation intestinale5,6,7. En tant qu’antigène immunodominant du microbiote intestinal, la flagelline CBir1 a été liée à la pathogenèse de CD8,9 chez l’homme. De plus, le transfert de lymphocytes T transgéniques (Tg) CBir1 TCR induit une inflammation intestinale chez les souris immunodéficientes6, ressemblant étroitement à la MII humaine, ce qui indique que ce modèle de transfert de lymphocytes T aide à étudier les mécanismes de la MII humaine.
Ce travail décrit le protocole détaillé d’induction de la colite chez les souris Rag1-/- par transfert adoptif des lymphocytes T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ et l’évaluation de la gravité de la maladie. En outre, les résultats attendus sont montrés, et les étapes critiques de la procédure et du dépannage sont discutées, ce qui aidera les chercheurs à étudier les mécanismes de pathogenèse de l’inflammation intestinale et à tester les médicaments potentiels pour traiter les MII.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que chaque étape soit essentielle à la reproductibilité de ce modèle de colite, il existe plusieurs étapes critiques. Les souris Rag-/- receveuses doivent recevoir suffisamment de lymphocytes T NAΪve CD4+ viables adéquats pour induire une inflammation intestinale. Nous avons utilisé des rates pour isoler les lymphocytes T CD4+ naïfs au lieu des MLN. Parce que le rendement des lymphocytes T CD4+ naïfs dans les MLN est beaucoup plus faible que dans la rate…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par les subventions DK125011, AI150210 et DK124132 des National Institutes of Health, le prix STARs system de l’Université du Texas (Y.C.) et le James W. McLaughlin Fellowship Fund de la branche médicale de l’Université du Texas à Galveston (W.Y.). La figure 1 a été créée avec BioRender.com.
Materials
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
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