تحريض التهاب الأمعاء عن طريق النقل المتبني للخلايا التائية المعدلة وراثيا CBir1 TCR CD4 + إلى الفئران التي تعاني من نقص المناعة
Summary
في هذا البروتوكول ، يتم وصف نموذج التهاب القولون المنقول بالخلية التائية الخاص بمستضد الأمعاء. يتم عزل الخلايا التائية CD4+ من الفئران المعدلة وراثيا CBir1 TCR. هذه خاصة بمستضد ميكروبات الأمعاء المهيمنة على المناعة CBir1 السوط ، والذي يتم نقله إلى الفئران المتلقية Rag1–/- ، مما يؤدي إلى التهاب الأمعاء.
Abstract
مع زيادة معدل الإصابة ، تفرض أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) ، وهي أمراض مزمنة تؤثر على الجهاز الهضمي ، عبئا صحيا وماليا كبيرا على الأفراد والمجتمع. لذلك ، من الأهمية بمكان التحقيق في الآليات الكامنة وراء التسبب في مرض الأمعاء الالتهابي وتطوره. هنا ، يتم وصف نموذج التهاب القولون نقل الخلايا التائية الخاص بمستضد الميكروبات المعوية. تم التعرف على السوط CBir1 باعتباره المستضد البكتيري المعوي المناعي في التهاب القولون التجريبي والمرضى الذين يعانون من مرض كرون. CBir1 TCR naϊve CD4+ الخلايا التائية المعدلة وراثيا ، الخاصة ب CBir1 السوط ، يمكن أن تحفز التهاب القولون المزمن بعد النقل بالتبني إلى الفئران Rag1–/- التي تعاني من نقص المناعة. يتم تقييم شدة المرض من قبل علم الأنسجة المرضية. كما يتم تحديد الأنماط الظاهرية للخلايا التائية CD4+ في الصفيحة القولونية. يشبه هذا النموذج إلى حد كبير تطور مرض الأمعاء الالتهابي، الذي يوفر نموذجا مثاليا للفئران للتحقيق في الآليات التي تقود التسبب في مرض الأمعاء الالتهابي واختبار الأدوية المحتملة لعلاج مرض الأمعاء الالتهابي.
Introduction
تتميز أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD)، بما في ذلك بشكل رئيسي مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC)، بالتهاب مزمن وانتكاسي في الجهاز الهضمي، مما يؤثر على الملايين في جميع أنحاء العالم1. وقد تورطت عدة عوامل في تطور مرض الأمعاء الالتهابي والتسبب فيه، بما في ذلك القابلية الوراثية، وميكروبات الأمعاء، والاستجابات المناعية، والنظام الغذائي، ونمط الحياة2. ومع ذلك ، فإن الآلية الدقيقة ل IBD لا تزال غير مفهومة تماما.
أحد الاهتمامات الخاصة هو التفاعل بين ميكروبات الأمعاء والاستجابات المناعية للمضيف في تنظيم التهاب الأمعاء3. توفر ميكروبات الأمعاء سلسلة من الجزيئات والمستضدات المناعية المحفزة للمناعة، والتي يمكن أن تنشط الاستجابات المناعية4. في حين أن التوازن بين الخلايا التائية المستجيبة والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على التوازن المعوي ، فإن استجابة الخلايا التائية المخاطية المعوية CD4 + T المفرطة لمستضدات ميكروبات الأمعاء تساهم في التهاب الأمعاء5،6،7. كمستضد ميكروبات الأمعاء المناعية ، ارتبط السوط CBir1 بالتسبب في CD8,9 البشري. وعلاوة على ذلك، فإن نقل الخلايا التائية المعدلة وراثيا CBir1 TCR (Tg) يحفز الالتهاب المعوي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة6، وهو ما يشبه إلى حد كبير مرض الأمعاء الالتهابي البشري، مما يشير إلى أن نموذج نقل الخلايا التائية هذا يساعد في التحقيق في آليات مرض الأمعاء الالتهابي البشري.
يصف هذا العمل البروتوكول التفصيلي للحث على التهاب القولون في الفئران Rag1–/- عن طريق النقل المتبني للخلايا التائية CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ وتقييم شدة المرض. إلى جانب ذلك ، يتم عرض النتائج المتوقعة ، ومناقشة الخطوات الحاسمة للإجراء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، مما سيساعد الباحثين على التحقيق في آليات التسبب في التهاب الأمعاء واختبار الأدوية المحتملة لعلاج مرض الأمعاء الالتهابي.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن كل خطوة ضرورية لتكرار نموذج التهاب القولون هذا ، إلا أن هناك العديد من الخطوات الحاسمة. يجب أن تتلقى الفئران Rag–/- المتلقية خلايا naϊve CD4 + T كافية قابلة للحياة للحث على التهاب الأمعاء. استخدمنا الطحال لعزل الخلايا التائية CD4+ الساذجة بدلا من MLNs. لأن غلة خلا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DK125011 و AI150210 و DK124132 ، وجائزة جامعة تكساس System STARs (Y.C.) ، وصندوق زمالة James W. McLaughlin من الفرع الطبي لجامعة تكساس في Galveston (W.Y). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.
Materials
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
- Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
- Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
- Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
- Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. . Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
- Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
- Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells’ differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
- Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
- Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
- Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn’s disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
- Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
- Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
- Yang, W., et al. . Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457 (2020).
- Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
- Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn’s disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
- Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533 (2015).
- Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
- Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
- Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555 (2018).
- Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
- Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. . T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
- Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).
