CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도
Summary
본 프로토콜에서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 입양 상반염 모델이 기재된다. CD4+ T 세포는 CBir1 TCR 형질전환 마우스로부터 분리된다. 이들은 면역 지배적인 창자 microbiota 항원 CBir1 flagellin를 위해 특정합니다, 수신자 Rag1/– 마우스로 전송되는, 장 염증으로 이끌어 내는.
Abstract
부각의 증가와 함께, 염증성 장 질환 (IBD), 위 장관에 영향을 미치는 만성 질환은 개인과 사회에 상당한 건강 및 재정적 부담을 부과. 따라서 IBD의 발병 기제 및 개발의 근간을 조사하는 것이 중요합니다. 여기서, 장내 미생물-항원 특이적 T 세포 전달 대장염 모델이 기재되어 있다. CBir1 flagellin 실험 대장염및 크론병 환자에서 면역 지배적 인 장 세균 항원으로 인식되었습니다. CBir1 TCR 형질 전환기 naϊve CD4+ T 세포, CBir1 플래그렐린에 특정, 면역 결핍 Rag1/– 마우스로 입양 전송 후 만성 대장염을 유도할 수 있다. 질병 엄격은 조직 병리학에 의해 평가됩니다. 대장 라미나 프로프리아의 CD4+ T 세포 표현형도 결정된다. 이 모델은 IBD의 발병을 유도하는 메커니즘을 조사하고 IBD 를 치료하기위한 잠재적 인 약물을 테스트하기위한 이상적인 뮤린 모델을 제공하는 IBD의 개발과 유사합니다.
Introduction
크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)을 중심으로 염증성 장질환(IBD)은 위장관의 만성 재발 염증을 특징으로 하며 전 세계 수백만 명에게 영향을 미치고 있습니다1. 유전 감수성, 창자 미생물, 면역 반응, 규정식 및 생활양식2를 포함하여 IBD의 발달 그리고 병신에 몇몇 요인이 연루되었습니다. 그러나 IBD의 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않습니다.
특정 관심사 중 하나는 장 내 염증 조절에 있어 장 내 미생물군유상과 호스트 면역 반응 사이의 상호 작용입니다3. 장내 미생물은 면역 반응을 활성화할 수 있는 일련의 면역 자극 분자 및 항원을 제공합니다4. 이펙터 T 세포와 조절 T 세포 사이의 균형 (Tregs) 장 항상성을 유지에 중요 한 동안, 창 자 microbiota 항 원에 과도 한 장 점막 CD4+ T 세포 응답 장 염증에 기여 5,6,7. 면역 지배적 인 창 자 microbiota 항원으로, CBir1 flagellin 인간 CD8,9의 발병기와 관련 되어 있다. 더욱이, CBir1 TCR 형질전환(Tg) T 세포의 전달은 면역 결핍 마우스6에서 장 염증을 유도하며, 인간 IBD와 밀접하게 닮은 이 T 세포 전달 모델이 인간 IBD의 메커니즘을 조사하는 데 도움이 된다는 것을 나타낸다.
이 작품은 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포의 입양 전송에 의해 Rag1/-마우스에서 대장염을 유도하고 질병 심각도를 평가하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 게다가, 예상된 결과가 표시되고, 절차 및 문제 해결의 중요한 단계는 연구원이 장 염증의 병인의 기계장치를 조사하고 IBD 취급을 위한 잠재적인 약을 시험하는 것을 도울 것입니다 토론됩니다.
Protocol
모든 동물 절차는 동물의 사용 및 관리에 대한 텍사스 대학 의료 지부의위원회에 따라 수행되었다. CBir1 TCR Tg 마우스는 버밍엄에 있는 알라바마 대학의 찰스 엘슨 박사에 의해 제공되었습니다. CBir1 TCR Tg 마우스는 여성 또는 남성일 수 있지만 8-12 주에 있어야 합니다. C57BL/6 배경에 있는 Rag1/– 마우스는 잭슨 연구소10으로부터 수득되었다. Rag1/- 마우?…
Representative Results
약 5 x 106 CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포는 성인 CBir1 TCR Tg 마우스로부터 분리되었다. CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ T 세포의 전송은 수신자 Rag1/– 마우스에서 만성 대장염을 유도. 세포 전달 후, 임상 징후는 체중 감소, 대변 일관성 및 구부러진 자세를 포함하여 장 염증의 진행을 평가하기 위해 모니터링되었습니다. 예상대로, 마우스는 세포 전달 후 약 3 주 동안 무게를 잃기…
Discussion
모든 단계는이 대장염 모델의 재현성에 필수적이지만 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 수령인 Rag/- 마우스는 장 염증을 유도하기 위하여 CD4+ T 세포에 적당한 실행 가능한 naϊve 수신해야 합니다. 우리는 MLN 대신 순진한 CD4 + T 세포의 격리를 위해 비장을 사용했습니다. MLN에서 순진한 CD4 + T 세포의 수율은 비장보다 훨씬 낮기 때문입니다. CD62L은 순진한 T 세포…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원 보조금 DK125011, AI150210, DK124132, 텍사스 시스템 STARs 상 (Y.C.), 그리고 갤버스턴 (W.Y.)의 텍사스 대학 의료 지부에서 제임스 W. 맥러플린 펠로우십 기금에 의해 부분적으로 지원되었다. 그림 1은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.
Materials
| 0.22 µm vacuum-driven disposable bottle top filter | MilliporeSigma | SCGPS05RE | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| 100-µm strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 3-mL Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-9CM | |
| Anti-Mouse CD16/32 | Biolegend | 101302 | |
| Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 102030 | |
| Anti-mouse CD3-Percp/Cy5.5 | Biolegend | 100327 | |
| Anti-Mouse CD4 APC | Biolegend | 100516 | |
| Anti-Mouse CD4 Magnetic Particles | BD Biosciences | 551539 | |
| Anti-Mouse CD4-BV421 | Biolegend | 100544 | |
| Anti-Mouse CD62L-PE | Biolegend | 104408 | |
| Anti-Mouse Foxp3-PE | ThermoFisher | 12-5773-82 | |
| Anti-Mouse IFNγ-FITC | Biolegend | 505806 | |
| Anti-Mouse IL-17A-PE/Cy7 | Biolegend | 506922 | |
| Automated Cell Counter | Bio-rad | TC20 | |
| Brefeldin A | BD Biosciences | 555029 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP1600-1 | |
| C tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Cell Separation Magnet | BD Biosciences | 552311 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dissociator Machine | Miltenyi | 130-096-427 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| EDTA (0.5 M, PH 8.0) | Corning | 46-034-CI | |
| FBS | R&D Systems | S11550 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSD Fortessa | |
| Heat Lamp | CoverShield | BR40 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Stain Kit | Abcam | ab245880 | |
| Insulin Syringes | BD Biosciences | 329412 | |
| Ionomycin | ThermoFisher | I24222 | |
| Live/dead Fixable Near-IR Dead Cell Stain kit | ThermoFisher | L10119 | |
| MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Stackable Shakers | ThermoFisher | SHKE6000 | |
| NH4Cl | Thermo Scientific | A687-500 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Phorbol-12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640 Medium | Cytiva HyClone | SH3002702 | |
| Sorter | BD Biosciences | Arial Fusion | |
| Tissue Automatic Processor | ThermoFisher | STP120 | |
| Tissue Embedding/Processing Cassette | Fisher Healthcare | 22048142 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | BP154-1 | |
| True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (including Perm Buffer) | Biolegend | 424401 |
References
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Citer Cet Article
Yang, W., Yu, T., Cong, Y. Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (178), e63293, doi:10.3791/63293 (2021).