使用旋转细胞培养系统在模拟微重力下培养淋巴细胞

Summary

这是使用市售旋转细胞培养系统使用专用一次性培养容器在模拟微重力下培养淋巴细胞的分步指南。该培养方法可应用于任何悬浮型细胞培养物。

Abstract

鉴于目前在太空中进行生物学研究的局限性，在地球上将细胞培养置于模拟微重力（SMG）下存在一些选择。这些选项的方法、原理和与悬浮细胞培养的适用性各不相同。这里描述了一种细胞培养方法，用于使用市售的旋转细胞培养系统（也称为2D clinostat或旋转壁容器（RWV）装置）对淋巴细胞进行模拟微重力。这种细胞培养方法利用时间平均重力矢量零化的原理，通过在水平轴上旋转细胞来模拟微重力。该系统中培养的细胞可以收获并用于许多不同的实验测定，以评估模拟微重力对细胞功能和生理的影响。根据所使用的细胞类型或品系，培养技术可能略有不同，但此处描述的方法可以应用于任何悬浮型细胞培养物。

Introduction

太空飞行已被证明会影响人体生理学的许多方面，包括免疫系统。许多研究已经证明了由于体内太空飞行和体外暴露于模拟微重力（SMG）而导致免疫失调的证据1，²，^3，4。 影响人体生理的空间环境的一个主要方面是微重力。微重力是指由于空间环境中的低引力而经历的“失重”⁵。随着人类准备进行更长的月球和火星太空任务，需要进行更多的研究来减轻宇航员的严重健康风险。

科学研究的真正微重力条件可以在国际空间站（ISS）上的空间或发射到轨道的纳米卫星中实现;但是，这些选项的编排成本和复杂性可能非常高。鉴于目前在太空中进行生物研究的局限性，在地球上诱导真正的微重力和冲锋枪有几种选择。存在可以在地球上产生短时间真实微重力的大规模操作，包括落塔，抛物线飞行和探空火箭。然而，这些方法并不太适合研究微重力对生物系统的影响，主要是因为它们的微重力处理时间短（即几秒钟到20分钟）。这些方法将在别处更详细地讨论5^，6。适用于生物细胞培养的选项包括小型设备，例如2D恒温器或旋转壁容器（RWV）设备以及3D恒温器或随机定位机（RPM）。这些设备可以设置在保持在37°C和5%CO₂的细胞培养箱内，它们在水平轴（2D）或两个垂直轴（3D^）上旋转细胞培养物5。然而，重要的是要强调，这些培养方法产生的SMG而不是真正的微重力，这在生物研究环境中的太空中最为可行。

本文的目的是概述使用市售RWV设备（材料表）对淋巴细胞进行SMG的步骤，该设备属于2D恒温器分类。虽然制造商提供了用于操作此设备的通用协议，但本文旨在更详细地介绍故障排除和优化步骤。本文还介绍了该装置如何在悬浮细胞培养中产生SMG的理论，特别是淋巴细胞。在这种情况下，悬浮细胞培养是指细胞在补充培养基中自由生长，而不粘附在任何额外的支架上。许多细胞类型在悬浮细胞培养中生长，包括淋巴细胞。淋巴细胞是免疫系统的细胞，包括T，B和自然杀伤（NK）细胞，存在于淋巴器官和血液中⁷。

此处描述的RWV 2D恒温器的工作原理是时间平均重力载体^无效5，6，⁸，^9，其中通过水平轴上旋转细胞培养物来随机化重力载体。这是通过将培养容器的旋转速度与细胞的沉降速度相匹配来实现的。只要培养容器的旋转速度与细胞的沉降速度匹配良好，细胞就会保持自由落体，无法沉降，就像在太空环境中所经历的那样。经过初始加速阶段后，培养皿中的培养基最终会随着时间的推移达到“固体旋转”。这种水平旋转也会在细胞培养容器中诱导层流。这创造了一个“低剪切”环境，因为层流在细胞上引起的剪切应力远小于湍流的剪切应力。然而，鉴于clinostat不是一个完美的系统，引入了一些小的层流流体运动，这对细胞造成的剪切应力最小。因此，悬浮在培养基中的细胞在旋转过程中被这种流动拖曳。在水平旋转过程中，重力矢量作用于细胞并使它们进入振荡轨迹，如图 1 所示。剪切应力的另一个小来源是由细胞“落”通过培养基引起的，导致细胞周围的层流。当培养容器在水平轴上旋转时，细胞经历的重力矢量也会旋转。随着时间的推移，这个旋转的重力矢量平均接近零;这种现象称为时间平均重力矢量无效，并诱导SMG⁵，⁶，^8，9的状态。该装置已被用于研究SMG对许多类型细胞的影响，其中一些在参考文献^10，11，12中有所涉及。更多示例可在设备制造商的网站上找到。

此 RWV 设备使用设备制造商提供的专用“高纵横比容器”（HARV）。这些 HARV 每个可容纳 10 mL 细胞培养物;但是，也可以使用 50 mL HARV。可以使用 10 mL 或 50 mL HARV，具体取决于完成任何下游实验测定所需的细胞数量，这将在讨论部分进一步概述。HARV由聚碳酸酯制成，包括硅氧合膜，允许在细胞培养过程中进行气体交换。这维持了细胞培养基的pH值，并允许有效的细胞呼吸。容器表面有一个主填充口和两个带盖的注射器端口（图2A）。通过主进样口装载细胞培养物后，将两个注射器装载到容器上以协助去除气泡。使用 10 mL 容器时，两个 3 mL 注射器工作良好。一个注射器连接到设备是空的，注射器完全压下，另一个连接着填充有3mL细胞培养物（图2E）。这些组合用于去除容器中的气泡，这对于维持SMG处理很重要。一般来说，建议设置两个阴性对照，可以称为“烧瓶”对照和“1G”对照。“Flask”对照对应于在标准T25悬浮细胞培养瓶中生长的细胞。1G对照对应于在专门的10 mL培养容器中生长的细胞，该培养容器只需放置在培养箱中（即，无需进行SMG处理）。有关控件的更多详细信息，请参阅“讨论”部分。

这里描述的方法适用于任何希望研究SMG对淋巴细胞影响的研究人员，特别是通过使用NK92细胞系¹³来研究NK细胞。这些研究的结果可能有助于我们更好地了解和减轻太空飞行对人体免疫系统的不利影响。

Protocol

注意：以下步骤应在无菌生物安全柜内完成。 1. 细胞培养容器的制备 将培养皿从塑料包装中取出。根据所使用的细胞类型/细胞系，是对照（1G）还是处理（SMG）以及任何其他相关信息，在边缘标记每个容器。 稳定容器并小心打开加注口，不要接触加注口盖钉/O 形圈。将盖子放在乙醇垫上，将钉子/O 形圈朝上，同时填充容器。不要从注射器端口上?…

Representative Results

如果1）细胞的增殖在对照组（理想情况下是所有实验组）中大致一致，2）考虑到接种密度，处理时间和细胞类型/系的倍增时间，增殖是合适的，并且3）收获的细胞的活力为85%或更高（表1).理想情况下，所得细胞应与标准细胞培养物一样健康，特别是用于后续实验和测定（即活力为85%或更高）。如果情况正好相反，则认为这种培养方法不成功，即产生的细胞要么死亡，要么在对照组?…

Discussion

随着人类准备进行更长的月球和火星太空任务，需要进行更多的研究来减轻宇航员的严重健康风险。影响人体生理的空间环境的一个主要方面是微重力。本文描述了一种使用市售旋转细胞培养系统对淋巴细胞进行SMG的细胞培养方法。

该协议包含一些关键步骤，可能需要根据所使用的细胞类型或品系进行优化。这些包括1）根据细胞的倍增时间和SMG处理的长度选择合适的接种密?…

Materials

Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL)	Synthecon	D-410	Gamma sterilized culture vessels (4/box)
Luer-Lok tip syringes (3 mL)	BD	309657	For attaching to the 10 mL HARVs
NK92 Cell-line	ATCC	CRL-2407
Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4D	Rotating wall vessel device; 2D clinostat
Sarsedt 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-220
Sarsedt 50 mL conical tubes	Fisher Scientific	50-809-218
Sarsedt sterile serological pipettes	Fisher Scientific	86.1254.001
T25 suspension culture flasks	Sarsedt	83.3910.502	For flask control