Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit einem rotierenden Zellkultursystem
Summary
Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems zur Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit speziellen Einweg-Kulturgefäßen. Diese Kultivierungsmethode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.
Abstract
Angesichts der derzeitigen Einschränkungen der biologischen Forschung im Weltraum gibt es einige Möglichkeiten, Zellkulturen auf der Erde einer simulierten Schwerelosigkeit (SMG) auszusetzen. Diese Optionen unterscheiden sich in ihren Methoden, Prinzipien und ihrer Eignung für die Verwendung mit Suspensionszellkulturen. In dieser Arbeit wird ein Zellkulturverfahren beschrieben, bei dem Lymphozyten unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems, auch bekannt als 2D-Klinostat oder Rotating Wall Vessel (RWV)-Gerät, einer simulierten Schwerelosigkeit ausgesetzt werden. Diese Zellkulturmethode nutzt das Prinzip der zeitgemittelten Gravitationsvektoraufhebung, um die Schwerelosigkeit zu simulieren, indem die Zellen um eine horizontale Achse gedreht werden. Die in diesem System kultivierten Zellen können geerntet und in vielen verschiedenen experimentellen Assays verwendet werden, um die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf die zelluläre Funktion und Physiologie zu bewerten. Die Kultivierungstechnik kann je nach verwendetem Zelltyp oder Zelllinie leicht variieren, aber die hier beschriebene Methode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.
Introduction
Es hat sich gezeigt, dass die Raumfahrt viele Aspekte der menschlichen Physiologie beeinflusst, einschließlich des Immunsystems. Viele Studien haben Hinweise auf eine Fehlregulation des Immunsystems als Folge von Raumflügen in vivo und Exposition gegenüber simulierter Schwerelosigkeit (SMG) in vitro gezeigt 1,2,3,4. Ein wichtiger Aspekt der Weltraumumgebung, der sich auf die menschliche Physiologie auswirkt, ist die Schwerelosigkeit. Mikrogravitation bezieht sich auf die “Schwerelosigkeit”, die aufgrund geringer Gravitationskräfte in der Weltraumumgebung erlebtwird 5. Während sich die Menschheit auf längere Weltraummissionen zu Mond und Mars vorbereitet, muss mehr Forschung betrieben werden, um ernsthafte Gesundheitsrisiken bei Astronauten zu mindern.
Echte Schwerelosigkeitsbedingungen für die wissenschaftliche Forschung können im Weltraum an Bord der Internationalen Raumstation (ISS) oder in Nanosatelliten, die in den Orbit gebracht werden, erreicht werden. Diese Optionen können jedoch unglaublich kostspielig und komplex in der Orchestrierung sein. Angesichts der derzeitigen Einschränkungen der biologischen Forschung im Weltraum gibt es mehrere Möglichkeiten, echte Schwerelosigkeit und SMG auf der Erde zu induzieren. Es gibt groß angelegte Operationen, die kurze Perioden echter Schwerelosigkeit auf der Erde erzeugen können, darunter Falltürme, Parabelflüge und Höhenforschungsraketen. Diese Methoden sind jedoch nicht übermäßig geeignet, um die Auswirkungen der Schwerelosigkeit auf biologische Systeme zu untersuchen, was vor allem auf ihre kurzen Zeiträume der Mikrogravitationsbehandlung (d. h. Sekunden bis 20 Minuten) zurückzuführen ist. Diese Methoden werden an anderer Stelle ausführlicher erörtert 5,6. Zu den Optionen, die für die biologische Zellkultur geeignet sind, gehören kleine Geräte wie 2D-Klinostate oder RWV-Geräte (Rotating Wall Vessel) und 3D-Klinostate oder Zufallspositioniermaschinen (RPM). Diese Geräte können in Zellkulturinkubatoren bei 37 °C und 5 % CO2 aufgestellt werden und drehen die Zellkultur entweder um eine horizontale Achse (2D) oder um zwei senkrechte Achsen (3D)5. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass diese Kultivierungsmethoden SMG erzeugen, im Gegensatz zur echten Schwerelosigkeit, die im Weltraum für biologische Forschungskontexte am besten erreicht werden kann.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Schritte zur Subvention von Lymphozyten mit SMG unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RWV-Geräts (Table of Materials) zu skizzieren, das unter die 2D-Klinostat-Klassifikation fällt. Während es vom Hersteller ein allgemeines Protokoll für den Betrieb dieses Geräts gibt, zielt der aktuelle Artikel darauf ab, die Schritte zur Fehlerbehebung und Optimierung genauer zu behandeln. Dieser Artikel behandelt auch die Theorie hinter der Funktionsweise dieses Geräts zur Herstellung von SMG in Suspensionszellkultur, insbesondere mit Lymphozyten. Suspensionszellkultur bezieht sich in diesem Zusammenhang auf Zellen, die in supplementierten Nährmedien frei wachsen, ohne an einem zusätzlichen Gerüst zu haften. Viele Zelltypen werden in Suspensionszellkultur gezüchtet, darunter auch Lymphozyten. Lymphozyten sind Zellen des Immunsystems, einschließlich T-, B- und natürlicher Killerzellen (NK), die sich in lymphatischen Organen und im Blutkreislauf befinden7.
Der hier beschriebene RWV-2D-Klinostat arbeitet nach dem Prinzip der zeitlich gemittelten Gravitationsvektor-Nullifikation 5,6,8,9, wobei der Gravitationsvektor durch Rotation der Zellkultur um eine horizontale Achse randomisiert wird. Dies wird erreicht, indem die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen angepasst wird. Solange die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes gut auf die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen abgestimmt ist, bleiben die Zellen im freien Fall und können nicht sedimentieren, wie es in der Weltraumumgebung der Fall ist. Nach einer anfänglichen Beschleunigungsphase erreicht das Medium im Kulturgefäß schließlich mit der Zeit eine “Festkörperrotation”. Diese horizontale Rotation induziert auch eine laminare Strömung im Zellkulturgefäß. Dadurch entsteht eine “scherarme” Umgebung, da die Scherspannung, die durch laminare Strömung auf die Zellen induziert wird, viel geringer ist als die der turbulenten Strömung. Da der Klinostat jedoch kein perfektes System ist, gibt es einige kleine, laminare Flüssigkeitsbewegungen, die eine minimale Scherspannung auf die Zellen ausüben. So werden die im Medium schwebenden Zellen bei der Rotation von dieser Strömung mitgerissen. Während der horizontalen Rotation wirkt der Schwerkraftvektor auf die Zellen und bringt sie in eine oszillierende Bahn, wie in Abbildung 1 dargestellt. Eine weitere kleine Quelle der Scherspannung wird dadurch verursacht, dass die Zellen durch das Medium “fallen” und eine laminare Strömung um die Zellen herum verursachen. Wenn sich das Kulturgefäß um eine horizontale Achse dreht, dreht sich auch der Schwerkraftvektor, den die Zellen erfahren. Im Laufe der Zeit wird dieser rotierende Schwerkraftvektor gemittelt, um gegen Null zu gehen. Dieses Phänomen wird als zeitgemittelte Gravitationsvektor-Nullifikation bezeichnet und induziert einen Zustand vonSMG 5,6,8,9. Dieses Gerät wurde verwendet, um die Auswirkungen von SMG auf viele Zelltypen zu untersuchen, von denen einige in den Referenzen10, 11, 12 behandelt werden. Weitere Beispiele finden Sie auf der Website des Geräteherstellers.
Dieses RWV-Gerät verwendet spezielle “High Aspect Ratio Vessels” (HARVs), die über den Gerätehersteller erhältlich sind. Diese HARVs fassen jeweils 10 ml Zellkultur; Es sind jedoch auch 50-ml-HARVs erhältlich. Es können entweder 10-ml- oder 50-ml-HARVs verwendet werden, je nachdem, wie viele Zellen benötigt werden, um nachgeschaltete experimentelle Assays durchzuführen, was im Abschnitt “Diskussion” näher erläutert wird. Die HARVs bestehen aus Polycarbonat und verfügen über eine Silikon-Oxygenierungsmembran, um den Gasaustausch während der Zellkultur zu ermöglichen. Dadurch wird der pH-Wert des Zellmediums aufrechterhalten und eine effiziente Zellatmung ermöglicht. An der Vorderseite des Gefäßes befinden sich eine Hauptfüllöffnung und zwei Spritzenöffnungen mit Verschluss (Abbildung 2A). Nachdem die Zellkultur durch die Hauptfüllöffnung geladen wurde, werden zwei Spritzen auf das Gefäß geladen, um die Blasenentfernung zu unterstützen. Bei Verwendung der 10-ml-Gefäße funktionieren zwei 3-ml-Spritzen gut. Eine Spritze wird leer auf das Gerät aufgesteckt, wobei die Spritze vollständig niedergedrückt ist, und die andere wird mit 3 ml Zellkultur gefüllt (Abbildung 2E). Diese werden in Kombination verwendet, um Blasen aus dem Gefäß zu entfernen, was für die Aufrechterhaltung der SMG-Behandlung wichtig ist. Im Allgemeinen wird empfohlen, zwei Negativkontrollen einzurichten, die als “Flask”-Kontrolle und “1G”-Kontrolle bezeichnet werden können. Die “Flask”-Kontrolle entspricht Zellen, die in einem Standard-T25-Suspensionszellkulturkolben gezüchtet werden. Die 1G-Kontrolle entspricht Zellen, die in dem speziellen 10-ml-Kulturgefäß gezüchtet werden, das einfach in den Inkubator gelegt wird (d. h. ohne SMG-Behandlung). Weitere Informationen zu den Steuerelementen finden Sie im Abschnitt “Diskussion”.
Die hier beschriebene Methode eignet sich für jeden Forscher, der die Auswirkungen von SMG auf Lymphozyten untersuchen möchte, mit besonderem Fokus auf NK-Zellen unter Verwendung der NK92-Zelllinie13. Die Ergebnisse dieser Studien könnten uns helfen, die negativen Auswirkungen der Raumfahrt auf das menschliche Immunsystem besser zu verstehen und abzumildern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während sich die Menschheit auf längere Weltraummissionen zu Mond und Mars vorbereitet, muss mehr Forschung betrieben werden, um ernsthafte Gesundheitsrisiken bei Astronauten zu mindern. Ein wichtiger Aspekt der Weltraumumgebung, der sich auf die menschliche Physiologie auswirkt, ist die Schwerelosigkeit. Hier wurde ein Zellkulturverfahren beschrieben, um Lymphozyten mit einem kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystem einem SMG zu unterziehen.
Dieses Protokoll enthält einige wi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von der Canadian Space Agency (CSA) mit einem Forschungsstipendium (17ILSRA3, Immuno Profile) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Roxanne Fournier (University of Toronto), Dr. Randal Gregg (Lincoln Memorial University) und Preteesh Mylabathula (University of Arizona) für ihre Hilfe bei der anfänglichen Fehlerbehebung dieses Protokolls.
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
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