रोटरी सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी में लिम्फोसाइटों की खेती
Summary
यह विशेष डिस्पोजेबल कल्चर वाहिकाओं का उपयोग करके सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी में लिम्फोसाइटों को कल्चर करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोटरी सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका है। इस संवर्धन विधि को किसी भी निलंबन-प्रकार की सेल संस्कृति पर लागू किया जा सकता है।
Abstract
अंतरिक्ष में जैविक अनुसंधान करने की वर्तमान सीमाओं को देखते हुए, पृथ्वी पर नकली माइक्रोग्रैविटी (एसएमजी) के लिए सेल संस्कृति के अधीन होने के लिए कुछ विकल्प मौजूद हैं। ये विकल्प निलंबन सेल संस्कृति के साथ उपयोग के लिए उनके तरीकों, सिद्धांतों और उपयुक्तता में भिन्न होते हैं। यहां, एक सेल कल्चर विधि को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोटरी सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके लिम्फोसाइटों को सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी के अधीन करने के लिए वर्णित किया गया है, जिसे 2 डी क्लिनोस्टेट या घूर्णन दीवार पोत (आरडब्ल्यूवी) डिवाइस के रूप में भी जाना जाता है। यह सेल कल्चर विधि क्षैतिज अक्ष पर कोशिकाओं को घुमाकर माइक्रोग्रैविटी का अनुकरण करने के लिए समय-औसत गुरुत्वाकर्षण वेक्टर शून्यीकरण के सिद्धांत का उपयोग करती है। इस प्रणाली में संवर्धित कोशिकाओं को सेलुलर फ़ंक्शन और शरीर विज्ञान पर सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी के प्रभावों का आकलन करने के लिए कई अलग-अलग प्रयोगात्मक परखों में काटा और उपयोग किया जा सकता है। संवर्धन तकनीक उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकार या रेखा के आधार पर थोड़ी भिन्न हो सकती है, लेकिन यहां वर्णित विधि किसी भी निलंबन-प्रकार सेल संस्कृति पर लागू की जा सकती है।
Introduction
स्पेसफ्लाइट को प्रतिरक्षा प्रणाली सहित मानव शरीर विज्ञान के कई पहलुओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। कई अध्ययनों ने विवो में अंतरिक्ष यान के परिणामस्वरूप प्रतिरक्षा विकृति और विट्रो 1,2,3,4 में सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी (एसएमजी) के संपर्क में आने के सबूत दिखाए हैं। अंतरिक्ष वातावरण का एक प्रमुख पहलू जो मानव शरीर विज्ञान को प्रभावित करता है वह माइक्रोग्रैविटी है। माइक्रोग्रैविटी अंतरिक्ष वातावरण में कम गुरुत्वाकर्षण बलों के कारण अनुभव की जाने वाली “भारहीनता” को संदर्भित करताहै। जैसा कि मानवता चंद्रमा और मंगल ग्रह पर लंबे अंतरिक्ष मिशनों के लिए तैयार है, अंतरिक्ष यात्रियों में गंभीर स्वास्थ्य जोखिमों को कम करने के लिए अधिक शोध किए जाने की आवश्यकता है।
वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए वास्तविक माइक्रोग्रैविटी स्थितियों को अंतर्राष्ट्रीय अंतरिक्ष स्टेशन (आईएसएस) पर अंतरिक्ष में या कक्षा में लॉन्च किए गए नैनोउपग्रहों में प्राप्त किया जा सकता है; हालाँकि, ये विकल्प अविश्वसनीय रूप से महंगे और व्यवस्थित करने के लिए जटिल हो सकते हैं। अंतरिक्ष में जैविक अनुसंधान करने की वर्तमान सीमाओं को देखते हुए, पृथ्वी पर वास्तविक माइक्रोग्रैविटी और एसएमजी को प्रेरित करने के लिए कई विकल्प मौजूद हैं। बड़े पैमाने पर संचालन मौजूद हैं जो पृथ्वी पर वास्तविक माइक्रोग्रैविटी की छोटी अवधि का उत्पादन कर सकते हैं, जिसमें ड्रॉप टॉवर, परवलयिक उड़ान और साउंडिंग रॉकेट शामिल हैं। हालांकि, ये विधियां जैविक प्रणालियों पर माइक्रोग्रैविटी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक उपयुक्त नहीं हैं, बड़े पैमाने पर माइक्रोग्रैविटी उपचार की छोटी अवधि (यानी, सेकंड से 20 मिनट) के कारण। इन विधियों पर कहीं और अधिक विस्तार से चर्चा की गईहै 5,6. जैविक सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त विकल्पों में छोटे पैमाने के उपकरण जैसे 2 डी क्लिनोस्टैट्स या घूर्णन दीवार पोत (आरडब्ल्यूवी) डिवाइस और 3 डी क्लिनोस्टैट्स या रैंडम पोजिशनिंग मशीन (आरपीएम) शामिल हैं। इन उपकरणों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बनाए गए सेल कल्चर इनक्यूबेटरों के अंदर स्थापित किया जा सकता है, और वे सेल संस्कृति को क्षैतिज अक्ष (2 डी) या दो लंबवत अक्षों (3 डी) 5 पर घुमाते हैं। हालांकि, इस बात पर जोर देना महत्वपूर्ण है कि ये संवर्धन विधियां वास्तविक माइक्रोग्रैविटी के विपरीत एसएमजी का उत्पादन करती हैं, जो जैविक अनुसंधान संदर्भों के लिए अंतरिक्ष में सबसे अधिक स्पष्ट रूप से प्राप्त होती है।
वर्तमान पेपर का लक्ष्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरडब्ल्यूवी डिवाइस (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके लिम्फोसाइटों को एसएमजी के अधीन करने के चरणों की रूपरेखा तैयार करना है, जो 2 डी क्लिनोस्टेट वर्गीकरण के अंतर्गत आता है। जबकि इस डिवाइस के संचालन के लिए निर्माता से एक सामान्य प्रोटोकॉल उपलब्ध है, वर्तमान लेख का उद्देश्य समस्या निवारण और अनुकूलन चरणों को अधिक विस्तार से कवर करना है। यह लेख इस सिद्धांत को भी शामिल करता है कि यह डिवाइस निलंबन सेल संस्कृति में एसएमजी का उत्पादन करने के लिए कैसे काम करता है, विशेष रूप से लिम्फोसाइटों के साथ। इस संदर्भ में, निलंबन सेल संस्कृति किसी भी अतिरिक्त मचान का पालन किए बिना पूरक संस्कृति मीडिया में स्वतंत्र रूप से बढ़ने वाली कोशिकाओं को संदर्भित करती है। लिम्फोसाइटों सहित निलंबन सेल संस्कृति में कई सेल प्रकार उगाए जाते हैं। लिम्फोसाइट्स प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाएं हैं, जिनमें टी, बी और प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं शामिल हैं, जो लिम्फोइड अंगों और रक्तप्रवाहमें रहती हैं।
यहां वर्णित आरडब्ल्यूवी 2 डी क्लिनोस्टेट समय-औसत गुरुत्वाकर्षण वेक्टर शून्यीकरण 5,6,8,9 के सिद्धांत पर काम करता है, जिससे गुरुत्वाकर्षण वेक्टर को क्षैतिज अक्ष पर सेल संस्कृति के रोटेशन के माध्यम से यादृच्छिक किया जाता है। यह कोशिकाओं के अवसादन वेग के लिए संस्कृति पोत के घूर्णी वेग का मिलान करके प्राप्त किया जाता है। जब तक संस्कृति पोत के घूर्णी वेग को कोशिकाओं के अवसादन वेग से अच्छी तरह से मेल खाता है, तब तक कोशिकाओं को मुक्त-पतन में बनाए रखा जाता है और तलछट में असमर्थ होता है, जैसा कि अंतरिक्ष वातावरण में अनुभव किया जाता है। प्रारंभिक गति-अप चरण के बाद, संस्कृति पोत में मीडिया अंततः समय के साथ “ठोस शरीर रोटेशन” तक पहुंच जाता है। यह क्षैतिज रोटेशन सेल कल्चर पोत में लैमिनार प्रवाह को भी प्रेरित करता है। यह एक “कम कतरनी” वातावरण बनाता है, यह देखते हुए कि लैमिनार प्रवाह द्वारा कोशिकाओं पर प्रेरित कतरनी तनाव अशांत प्रवाह की तुलना में बहुत कम है। हालांकि, यह देखते हुए कि क्लिनोस्टैट एक आदर्श प्रणाली नहीं है, कुछ छोटे, लैमिनार द्रव गतियां पेश की जाती हैं, जो कोशिकाओं पर न्यूनतम कतरनी तनाव पैदा करती हैं। इस प्रकार, मीडिया में निलंबित कोशिकाएं रोटेशन के दौरान इस प्रवाह द्वारा खींची जाती हैं। क्षैतिज रोटेशन के दौरान, गुरुत्वाकर्षण वेक्टर कोशिकाओं पर कार्य करता है और उन्हें एक ऑसिलेटिंग प्रक्षेपवक्र में लाता है, जैसा कि चित्र 1 में देखा गया है। कतरनी तनाव का एक और छोटा स्रोत मीडिया के माध्यम से कोशिकाओं के “गिरने” के कारण होता है, जिससे कोशिकाओं के चारों ओर लैमिनार प्रवाह होता है। जैसा कि संस्कृति पोत एक क्षैतिज अक्ष पर घूमता है, कोशिकाओं द्वारा अनुभव किया जाने वाला गुरुत्वाकर्षण वेक्टर भी घूमता है। समय के साथ, यह घूर्णन गुरुत्वाकर्षण वेक्टर औसत शून्य तक पहुंच जाता है; इस घटना को समय-औसत गुरुत्वाकर्षण वेक्टर शून्यीकरण कहा जाता है और एसएमजी 5,6,8,9 की स्थिति को प्रेरित करता है। इस उपकरण का उपयोग कई प्रकार की कोशिकाओं पर एसएमजी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिनमें से कुछ संदर्भ 10,11,12 में शामिल हैं। अधिक उदाहरण डिवाइस निर्माता की वेबसाइट पर पाए जा सकते हैं।
यह आरडब्ल्यूवी डिवाइस डिवाइस निर्माता के माध्यम से उपलब्ध विशेष “उच्च पहलू अनुपात जहाजों” (एचएआरवी) का उपयोग करता है। इन एचएआरवी में प्रत्येक में 10 एमएल सेल कल्चर होता है; हालाँकि, 50 एमएल एचएआरवी भी उपलब्ध हैं। या तो 10 एमएल या 50 एमएल एचएआरवी का उपयोग इस बात पर निर्भर करता है कि किसी भी डाउनस्ट्रीम प्रयोगात्मक परख को पूरा करने के लिए कितनी कोशिकाओं की आवश्यकता है, जिसे चर्चा अनुभाग में आगे उल्लिखित किया गया है। एचएआरवी पॉली कार्बोनेट से बने होते हैं और इसमें सेल कल्चर के दौरान गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए एक सिलिकॉन ऑक्सीकरण झिल्ली शामिल होती है। यह सेल मीडिया के पीएच को बनाए रखता है और कुशल सेलुलर श्वसन की अनुमति देता है। पोत के चेहरे पर एक मुख्य भरण बंदरगाह और दो कैप्ड सिरिंज बंदरगाह हैं (चित्रा 2 ए)। मुख्य भरण बंदरगाह के माध्यम से सेल संस्कृति को लोड करने के बाद, बुलबुला हटाने में सहायता के लिए पोत पर दो सिरिंज लोड किए जाते हैं। 10 एमएल जहाजों का उपयोग करते समय, दो 3 एमएल सिरिंज अच्छी तरह से काम करते हैं। एक सिरिंज डिवाइस से खाली जुड़ी होती है, जिसमें सिरिंज पूरी तरह से उदास होती है, और दूसरा 3 एमएल सेल कल्चर (चित्रा 2 ई) से भरा होता है। इनका उपयोग पोत से बुलबुले को हटाने के लिए संयोजन में किया जाता है, जो एसएमजी उपचार को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, दो नकारात्मक नियंत्रण स्थापित करने की सलाह दी जाती है, जिन्हें “फ्लास्क” नियंत्रण और “1 जी” नियंत्रण के रूप में संदर्भित किया जा सकता है। “फ्लास्क” नियंत्रण उन कोशिकाओं से मेल खाता है जो एक मानक टी 25 निलंबन सेल कल्चर फ्लास्क में उगाए जाते हैं। 1 जी नियंत्रण उन कोशिकाओं से मेल खाता है जो विशेष 10 एमएल संस्कृति पोत में उगाए जाते हैं, जिसे बस इनक्यूबेटर में रखा जाता है (यानी, एसएमजी उपचार के अधीन किए बिना)। नियंत्रणों के बारे में अधिक जानकारी के लिए कृपया चर्चा अनुभाग देखें.
यहां वर्णित विधि किसी भी शोधकर्ता के लिए उपयुक्त है जो लिम्फोसाइटों पर एसएमजी के प्रभावों का अध्ययन करना चाहते हैं, एनके 92 सेल लाइन13 का उपयोग करके एनके कोशिकाओं पर एक विशिष्ट ध्यान देने के साथ। इन अध्ययनों के परिणाम हमें मानव प्रतिरक्षा प्रणाली पर अंतरिक्ष यान के प्रतिकूल प्रभावों को बेहतर ढंग से समझने और कम करने में मदद कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि मानवता चंद्रमा और मंगल ग्रह पर लंबे अंतरिक्ष मिशनों के लिए तैयार है, अंतरिक्ष यात्रियों में गंभीर स्वास्थ्य जोखिमों को कम करने के लिए अधिक शोध किए जाने की आवश्यकता है। अंतरिक्ष वातावरण का एक प?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कनाडाई अंतरिक्ष एजेंसी (सीएसए), अनुसंधान अनुदान (17ILSRA3, इम्यूनो प्रोफाइल) द्वारा समर्थित है। रॉक्साने फोरनियर (टोरंटो विश्वविद्यालय), डॉ रैंडल ग्रेग (लिंकन मेमोरियल विश्वविद्यालय), और प्रितेश मायलाबाथुला (एरिज़ोना विश्वविद्यालय) को इस प्रोटोकॉल के प्रारंभिक समस्या निवारण में उनकी मदद के लिए स्वीकार करना और धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Disposible High Aspect Ratio Vessel (HARV) (10 mL) | Synthecon | D-410 | Gamma sterilized culture vessels (4/box) |
| Luer-Lok tip syringes (3 mL) | BD | 309657 | For attaching to the 10 mL HARVs |
| NK92 Cell-line | ATCC | CRL-2407 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Rotating wall vessel device; 2D clinostat |
| Sarsedt 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Sarsedt 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Sarsedt sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| T25 suspension culture flasks | Sarsedt | 83.3910.502 | For flask control |
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